肖亞朋，沈微，李婷霖，陳獻忠，樊游

1(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué)，中國高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)平臺，江蘇 無錫，214122)

嗜熱脂肪土芽孢桿菌普魯蘭酶基因的異源表達及重組酶性質(zhì)

肖亞朋1，沈微2*，李婷霖1，陳獻忠1，樊游2

1(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué)，中國高校工業(yè)微生物資源數(shù)據(jù)平臺，江蘇 無錫，214122)

用PCR方法擴增得到嗜熱脂肪土芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)XQ3506的普魯蘭酶編碼基因GsP，在大腸桿菌中進行異源表達。在沒有外源信號肽的條件下，重組酶部分分泌到周質(zhì)中，少量分泌到培養(yǎng)液中。重組酶表觀分子量約為81 kDa，純酶比活力為38.2 U/mg。重組酶最適溫度為60 ℃，能短時耐受70 ℃高溫；重組酶最適pH6.5，在pH5.5～7.5的范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性；重組酶Km值為0.086 μmol/L，Vmax為0.083 μmol/min；K+和Mg2+對重組酶有激活作用，而Ca2+則有抑制作用。重組酶水解普魯蘭糖產(chǎn)物為單一麥芽三糖，對直鏈淀粉未發(fā)現(xiàn)降解作用，是一種I型普魯蘭酶。重組酶GsP在直鏈淀粉、抗性淀粉生產(chǎn)和粉絲酶法生產(chǎn)工藝中有一定的應(yīng)用前景。

嗜熱脂肪土芽孢桿菌；異源表達；I型普魯蘭酶；蛋白純化；酶學(xué)性質(zhì)

普魯蘭酶是一類淀粉脫支酶，目前工業(yè)化生產(chǎn)的普主要是針對淀粉制糖工業(yè)中的糖化工藝開發(fā)的耐酸性普魯蘭酶[1-3]。近年來，隨著社會發(fā)展和產(chǎn)品的日益豐富，以普魯蘭酶為催化劑的新產(chǎn)品和新工藝不斷被開發(fā)，例如以普魯蘭糖為原料的麥芽三糖制作工藝[4]，以淀粉為原料的直鏈淀粉、抗性淀粉[5-7]生產(chǎn)工藝，以及粉絲酶法生產(chǎn)工藝[8]等都需要用到普魯蘭酶。在這些產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝中，反應(yīng)條件不一定是酸性，但酶的熱穩(wěn)定性都對反應(yīng)的順利進行、防止雜菌污染以及酶的節(jié)約使用有所幫助。嗜熱脂肪土芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)具有較高耐熱性，土芽孢桿菌屬的模式株即屬于該種。近年來，土芽孢桿菌屬的Geobacillusthermoleovorans，以及該屬的近緣種厭氧芽孢桿菌屬的普魯蘭酶基因先后被克隆并報道了酶學(xué)性質(zhì)[9-11]，而嗜熱脂肪土芽孢桿菌的普魯蘭酶基因的表達與重組酶性質(zhì)卻未見報道。本研究將報道嗜熱脂肪土芽孢桿菌 XQ3506普魯蘭酶基因在大腸桿中的高效表達以及重組酶的酶學(xué)性質(zhì)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

出發(fā)菌株嗜熱脂肪土芽孢桿菌和表達載體pLac03購自無錫先秦生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號分別為： XQ3506和XQ3619。G.stearothermophilusXQ3506的16S rDNA基因序列和pLac03全序列已登錄美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov)，登錄號分別為：KX674365和KX674364。XQ3506的16S rDNA基因序列與嗜熱脂肪土芽孢桿菌模式株IFO12550只有1個堿基差異。載體pLac03是一種以lac啟動子控制外源基因表達的大腸桿菌表達載體。

1.1.2 工具酶和主要試劑

核酸內(nèi)切酶EcoRI、HindIII，以及T4連接酶、ExtaqDNA聚合酶等均購自大連寶生物有限公司；膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司產(chǎn)品；氨芐青霉素、IPTG 、SDS均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；普魯蘭糖以及葡萄糖、麥芽糖等HPLC 檢測標(biāo)準(zhǔn)品均購自Sigma公司；考馬斯亮藍G-250購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；TB培養(yǎng)基購自北京吉美生物科技有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 引物

在NCBI公布的嗜熱脂肪土芽孢桿菌菌株22的基因組序列(登錄號：NZ_JQCS01000088.1)中有一條推測為普魯蘭酶編碼區(qū)的基因，據(jù)此設(shè)計擴增普魯蘭酶編碼基因GsP的引物如下：

Pgst1: 5’-AATTACCGGAATTCTTATGCTTCAC￣A￣T￣C￣AGCCGAAC-3’

Pgst2: 5’-AATTACCGGGATCCTTATTTTCCGT￣T￣T￣T￣C￣CAC-3’

引物Pgst1與魯蘭酶基因編碼區(qū)5’端一致，引物Pgst2與普魯蘭酶基因編碼區(qū)3’端互補，引物5’-端各添加了EcoRI和BamHI識別位點。引物設(shè)計后由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌重組表達載體的構(gòu)建

提取嗜熱脂肪土芽孢桿菌XQ3506的染色體DNA，以其為模板，用引物Pgst1和Pgst2進行PCR擴增，得到目標(biāo)基因片段，用EcoR和BamHI酶切，電泳分離后回收目的片段，與經(jīng)同樣酶切的表達載體pLac03連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 感受態(tài)細胞，在含氨芐青霉素的平板上挑取陽性轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒進行酶切驗證和測序。

1.2.2 重組普魯蘭酶誘導(dǎo)表達及產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

取重組菌單菌落接種含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。以1%的接種量轉(zhuǎn)接至含有氨芐青霉素的50 mL TB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌體的OD600達到0.8時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L繼續(xù)振蕩培養(yǎng)36 h，取適量菌液分別進行胞外、周質(zhì)和胞質(zhì)酶活檢測。檢測方法如下：12 000 r/min 離心1 min，收集上清液檢測胞外酶活。菌體重懸于含有25%(w/v)蔗糖的高滲處理液中，冰浴4 h，離心去上清，菌體重懸于與發(fā)酵液等體積的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，離心，上清液為周質(zhì)組分，沉淀部分超聲波破碎獲胞質(zhì)組分。SDS-PAGE電泳分析重組酶在細胞周質(zhì)及全細胞中的表達情況，使用Image Lab 4.0分析重組普魯蘭酶表觀分子量。

1.2.3 重組普魯蘭酶的純化與酶活測定

酶的純化方法：取周質(zhì)空間粗酶液2 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，pH 7.0，0.02 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液平衡后上QFF 1 mL陰離子交換柱，用含1 mol/L NaCl的pH 7.0，0.02 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液線形梯度洗脫，流速1 mL/min，自動部分收集器收集洗脫液，每管1 mL，逐管測定酶活力。然后SDS-PAGE 蛋白電泳驗證純化效果，考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，計算酶比活力，純化倍數(shù)和回收率。酶活檢測方法同文獻[3]。

1.2.4 重組普魯蘭酶酶學(xué)性質(zhì)研究

酶的最適溫度測定：在45～70 ℃的范圍內(nèi)，間隔5 ℃測定不同溫度對酶活性的影響，以最高酶活性為100%，計算各溫度條件下酶的相對活性。最適pH測定：在pH4.5～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，間隔0.5，測定酶活，以酶活最高者為100% ，計算相對酶活性。重組普魯蘭酶穩(wěn)定性測定：將酶液分別在50、55、60、65、70 ℃金屬浴中保溫，間隔1.5、3、4.5、6、7.5、9 h分別取樣測定酶活性，未經(jīng)熱處理的酶活性為100%，計算酶相對活性；金屬離子對酶活影響的測定：以10 mmol/L濃度的金屬離子鹽溶液代替反應(yīng)體系中的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，為避免金屬離子與磷酸根反應(yīng)，用去離子水替代緩沖液，用鹽酸或NaOH調(diào)整至pH6.5，對照用水取代金屬離子溶液，測定酶活力，對照為100%，計算酶相對活性。

1.2.5 重組普魯蘭酶動力學(xué)參數(shù)的測定

取8支1.5 mL離心管，依次加入濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 μmol/L 普魯蘭多糖溶液250 μL和最適pH緩沖液175 μL，預(yù)熱5 min，再各加75 μL適當(dāng)稀釋的純普魯蘭酶液(各管反應(yīng)體系中的底物終濃度依次為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μmol/L)，最適溫度下反應(yīng)5 min．空白管為對應(yīng)的不同濃度的底物250 μL+緩沖液175 μL+蒸餾水75 μL，最適溫度下進行反應(yīng)。沸水浴終止反應(yīng)后，DNS法測定還原糖量，計算不同底物濃度時的初速度(葡萄糖μmol/min)，用雙倒數(shù)作圖法求出酶的Km值和Vmax。

1.2.6 HPLC法分析重組普魯蘭酶水解普魯蘭多糖的產(chǎn)物

色譜條件：Waters XBridgeTMAmide液相色譜柱，流動相為乙腈-水(75∶25,V/V)，超聲波脫氣；柱溫35 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；檢測器為HITACHI高效液相色譜儀示差折光檢測器。采用外標(biāo)法進行標(biāo)定。

2 結(jié)果及分析

2.1 普魯蘭酶的異源表達與重組酶的純化

以嗜熱脂肪土芽孢桿菌 XQ3506基因組DNA為模板，用引物Pgst1、Pgst2進行PCR擴增，電泳顯示擴增產(chǎn)物約2.2 kb，與預(yù)計的嗜熱脂肪土芽孢桿菌普魯蘭酶基因編碼區(qū)一致，該編碼區(qū)片段命名為GsP。將上述PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pLac03連接，獲得重組質(zhì)粒pLac03-GsP。任取4個重組質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司測序。結(jié)果顯示，4個質(zhì)粒均為pLac03中插入GsP基因獲得的重組質(zhì)粒，4個質(zhì)粒中插入的GsP基因序列完全一致。GsP基因全序列已登錄美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，登錄號為：KX674366。利用Blast軟件將GsP與NCBI收集的全部核苷酸序列進行比對，結(jié)果顯示其與Rozanov等提交的嗜熱脂肪土芽孢桿菌22菌株的基因組序列(登錄號：NZ_JQCS01000088.1)中一段標(biāo)注為普魯蘭酶的序列相似性最高，兩者有21個堿基差異，所編碼的蛋白質(zhì)只有4個氨基酸殘基差異。與GsP同源性最高的有文獻報道重組酶酶學(xué)性質(zhì)的序列是AYADI等提交的來源于G.thermoleovorans的普魯蘭酶基因pulUS105[9]，兩者編碼區(qū)核苷酸序列相似性為79.9%，氨基酸序列相似性為82.5%。

將含重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒的大腸桿菌 JM109/pLac03-GsP和JM109/pLac03按1.2.2的方法進行培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達之后，分別對細胞不同組分進行酶活檢測，結(jié)果顯示，作為對照的大腸桿菌JM109/pLac03各組分中均檢測不到普魯蘭酶酶活。大腸桿菌 JM109/pLac03-GsP周質(zhì)空間和胞質(zhì)內(nèi)均檢測到較高的酶活，折算到等體積發(fā)酵液，其酶活分別為16.8 U/mL和46.7 U/mL，胞外培養(yǎng)液酶活為2.3 U/mL。進一步對重組菌全細胞、周質(zhì)空間組分進行SDS-PAGE 蛋白電泳檢測，結(jié)果見圖1。

M-蛋白marker; 1-JM109/pLac03-GsP周質(zhì)組分; 2-JM109/pLac03-GsP周質(zhì)組分純化蛋白; 3-JM109/pLac03周質(zhì)組分; 4-JM109/pLac03-GsP全細胞蛋白; 5-JM109/pLac03全細胞蛋白圖1 重組普魯蘭酶SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant pullulanase

由圖1可知，JM109/pLac03-GsP的全細胞蛋白和周質(zhì)空間蛋白在分子量80 kDa左右均有一明顯的差異表達條帶，同樣條帶在對照菌JM109/pLac03中均未出現(xiàn)。經(jīng)軟件Image Lab 4.0分析，重組蛋白相對分子質(zhì)量約為81 kDa，與按照GsP基因序列推測的普魯蘭酶理論分子量81.3 kDa基本一致。上述研究結(jié)果顯示，GsP基因的表達產(chǎn)物為普魯蘭酶。為便于敘述該重組酶命名為GsP。酶活檢測和蛋白電泳檢測結(jié)果顯示，GsP蛋白有相當(dāng)一部分可以分泌到周質(zhì)空間及細胞外，而本研究所使用的表達載體pLac03并沒有信號肽，用信號肽在線軟件分析也未發(fā)現(xiàn)GsP蛋白中存在Sec途徑或Tat途徑信號肽。為了對GsP蛋白的分泌現(xiàn)象進行分析，將GsP蛋白氨基酸序列與NCBI網(wǎng)站收集的芽孢桿菌科來源的蛋白進行搜索比對，結(jié)果顯示，在搜索結(jié)果中有文獻報道具有分泌能力的蛋白中與GsP氨基酸序列最接近的是來源于枯草芽孢桿菌的AmyX蛋白，氨基酸序列同源性約50%。AmyX是通過Tat途徑，即雙精氨酸途徑，以先折疊后分泌的方式分泌到細胞外，其N端有Tat途徑信號肽，其中第5、6位兩個相連的Arg是信號肽的核心區(qū)。GsP蛋白N端第6位仍然是Arg而第5位是Ser，這可能是信號肽分析軟件無法發(fā)現(xiàn)其信號肽的原因。GsP蛋白第3位His是Arg6附近唯一帶正電荷的氨基酸，這可能與其分泌功能有一定的關(guān)系。AYADI等研究pul US105的表達時發(fā)現(xiàn)在沒有外源信號肽時其編碼的普魯蘭酶不能分泌到周質(zhì)或細胞外[9]，這可能與其培養(yǎng)菌體時使用LB培養(yǎng)基有關(guān)，本研究中也發(fā)現(xiàn)用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的重組菌表達的GsP蛋白幾乎全部在細胞質(zhì)中。GsP蛋白的分泌功能將在后續(xù)工作中進一步研究，此次主要研究GsP的應(yīng)用性能。

由于周質(zhì)空間雜蛋白較少，取周質(zhì)空間粗酶液進行純化。SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖1的第2泳道)顯示，純化產(chǎn)物顯示為單一條帶，檢測結(jié)果顯示GsP純酶比活力為38.2 U/mg，純化倍數(shù)為3.37倍，回收率為73.09%。

2.2 重組普魯蘭酶活性與溫度和pH的關(guān)系

在pH 7.0條件下測定不同溫度下的酶活力，溫度-酶相對活性關(guān)系曲線見圖2。由圖2可見，GsP在55～60 ℃均有較高活性，60 ℃時活性略高，溫度高于60 ℃酶活性迅速下降。

圖2 溫度對GsP酶活的影響Fig.2 Effects of temperature on the activity of GsP

在60 ℃條件下，分別測定不同pH值條件下的酶活，pH值-酶活相對活性曲線見圖3。從圖3可見GsP對pH變化很敏感，最適pH6.5，在pH6.0和pH7.0時，酶活只有最高酶活的70%左右。

圖3 pH對GsP酶活的影響Fig.3 Effects of pH on the activity of GsP

2.3 重組普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性

將酶液分別在50、55、60、65、70 ℃保溫，間隔1.5 h分別取樣測定酶活性。由圖4可知，50 ℃和55 ℃保溫9 h后，剩余酶活性仍有80%以上，60 ℃處理9 h，剩余酶活在70%以上，證明該普魯蘭酶具有較好的熱穩(wěn)定性。進一步檢測顯示，在60 ℃，GsP的酶活半衰期大約為20 h。GsP在65 ℃下失活較快，在保溫1.5 h后酶活只剩40%左右，熱處理9 h后，殘存酶活不到15%。GsP能短時耐受70 ℃高溫。

圖4 GsP的熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of GsP

2.4 不同金屬離子對酶的催化活力的影響

幾種常見金屬離子對GsP酶活的影響如表1所示。K+和Mg2+能明顯促進GsP活性；Zn2+、Ca2+對GsP活性有明顯的抑制作用；Cu2+、Fe2+和Co2+三種重金屬對酶活有強烈抑制作用。Ca2+和Mg2+對GsP活性的影響與其對PUL US105的作用有所不同，AYADI等發(fā)現(xiàn)，Ca2+對PUL US105酶活有促進作用而Mg2+則有輕微的抑制[9]?？紤]到表1所采用的檢測溫度和金屬離子濃度與文獻有所不同，本研究進一步在金屬離子濃度為5 mmol/L，溫度為60 ℃和70℃條件下進行實驗，結(jié)果依然顯示Mg2+對酶活有明顯促進作用而Ca2+有抑制作用。從上述實驗結(jié)果看， PUL US105和GsP的穩(wěn)定性可能都需要金屬離子，Ca2+適合前者而Mg2+更適合后者。添加5 mmol/L Mg2+條件下，GsP在70 ℃下的酶活可以提高1倍以上。由于大部分淀粉的完全糊化溫度在65～70 ℃左右，這一性質(zhì)對GsP應(yīng)用于直鏈淀粉及抗性淀粉的制備有重要意義。

表1 不同金屬離子會對GsP催化活力的影響

2.5 重組普魯蘭酶的Km值和Vmax

在最適溫度55℃和最適pH6.5的條件下，按1.2.4的方法檢測GsP的動力學(xué)參數(shù)。計算不同底物濃度時的初速度(葡萄糖μmol/min)。利用Origin8.5做出重組普魯蘭酶催化普魯蘭多糖的V-[S]曲線圖(圖5)，并作出Linewaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖(圖6)。用雙倒數(shù)作圖法求出酶的Km值和Vmax。線性擬合得到的曲線方程為y=1.023x+11.9633，y代表反應(yīng)初速度的倒數(shù)，x代表底物濃度的倒數(shù)。由此得重組酶的Vmax=0.083 μmol/min；Km=0.086 μmol/L。

圖5 GsP催化普魯蘭多糖降解的V-[S]動力學(xué)曲線Fig.5 The V-[S]kinetic curve of the GsP catalyze pullulan degradation

圖6 雙倒數(shù)曲線圖Fig.6 Linewaver-Burk double reciprocal curve

2.6 重組普魯蘭酶對普魯蘭糖的降解

取濃度為1%的普魯蘭糖溶液與過量普魯蘭酶反應(yīng)，在普魯蘭糖完全降解后，降解產(chǎn)物進行HPLC檢測，結(jié)果見圖7。普魯蘭糖被降解后的產(chǎn)物中只有麥芽三糖。對標(biāo)準(zhǔn)樣的檢測顯示，葡萄糖、麥芽糖在同樣檢測條件下的響應(yīng)值大約是麥芽三糖的3倍，潘糖的響應(yīng)值與麥芽三糖相當(dāng)，由圖7可見在上述3種糖相應(yīng)的位置上均未見響應(yīng)。由此可知GsP特異性水解普魯蘭多糖的α-1,6-糖苷鍵，不降解α-1,4糖苷鍵。進一步將GsP與0.2%的直鏈淀粉溶液混合后在55 ℃反應(yīng)24 h，結(jié)果顯示，淀粉液反應(yīng)前后藍值沒有變化。可見GsP是一種專一性降解a-1,6糖苷鍵的I型普魯蘭酶。

圖7 普魯蘭多糖降解后的產(chǎn)物分析Fig.7 Analysis of degradation products of pullulan

3 討論

本研究以大腸桿菌為宿主，表達了嗜熱脂肪土芽孢桿菌來源的普魯蘭酶基因GsP，表達產(chǎn)物GsP專一性降解普魯蘭糖中的a-1,6糖苷鍵，是一種I型普魯蘭酶，純酶比活力為38.2 U/mg。GsP最適溫度為60℃，最適pH為6.5，能短時耐受70 ℃高溫，Mg2+能明顯提高酶活性及熱穩(wěn)定性。有一些文獻報道了來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermuphilus)的普魯蘭酶的性質(zhì)，但大多與GsP有明顯的差異。例如Kuriki在1988年先后報道了2種來源于B.stearothermophilus的DNA片段在枯草芽孢桿菌中表達的普魯蘭酶，其中來源于TRS40菌株的普魯蘭酶分子量62 kDa[12]，顯然與GsP不是同一分子。另一種來源于TRS128菌株的普魯蘭酶分子量為83 kDa，與GsP比較接近，但兩者酶學(xué)性質(zhì)差異很大，例如5 mmol/mL的CoCl2可以明顯促進前者酶活[13]，而同樣條件卻可以使GsP幾乎完全失活。國內(nèi)趙淑琴等報道了嗜熱脂肪芽孢桿菌1.1923來源的普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)[14-15]，與GsP相比前者具有較好的耐酸性，最適pH5.6，分子量55.6 kDa，從分子量判斷兩者不可能是同一種蛋白。產(chǎn)生上述差異的原因可能源于細菌分類標(biāo)準(zhǔn)的不同。土芽孢桿菌屬主要來源于對嗜熱脂肪芽孢桿菌的重新分類。B.stearothermuphilus建立于1920年，在其后近60年時間里是耐熱性芽孢桿菌的唯一有效分類單位，這導(dǎo)致大量親緣關(guān)系很遠的耐熱性細菌被歸入其中[16]。以后分類學(xué)工作者對其進行了多次重新分類，建立了土芽孢桿菌(Geobacillus)、厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus)等多個屬，將原屬于嗜熱脂肪芽孢桿菌的細菌歸入上述各個新建的屬，并撤銷了嗜熱脂肪芽孢桿菌這一分類單位[16]。本試驗對XQ3506菌株的鑒定主要是按照COORSVITS等在2012年建立的Geobacillus的新分類體系進行的，其中一個重要原則是種內(nèi)16S rDNA基因序列相似性要高于99.3%[16]。其他研究者的菌株來源于不同歷史階段，其分類體系不可能完全一致，這可能是產(chǎn)生差異的原因，由于上述文獻均未提供普魯蘭酶基因序列或菌株分類相關(guān)信息，其所用菌種在新分類體系中的地位難以確定。

經(jīng)過多年的努力，國內(nèi)外已有多種普魯蘭酶實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。表2是本課題組了解到的已經(jīng)或基本實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的幾種普魯蘭酶的應(yīng)用性能及其與GsP的比較。

表2所列5種普魯蘭酶均有較高的耐熱性，Anoxybacillussp. LM18-11來源的普魯蘭酶的性質(zhì)與GsP比較接近，均為中性普魯蘭酶，比較適合在直鏈淀粉、抗性淀粉生產(chǎn)及粉絲酶法制作工藝中應(yīng)用，因為這些工藝都可以在中性條件下反應(yīng)，特別是粉絲的酶法制作，必須在中性條件下進行反應(yīng)。另外3種普魯蘭酶都是為淀粉制糖工藝開發(fā)的，因此都是酸性普魯蘭酶。

綜上所述，本研究對嗜熱脂肪土芽孢桿菌的普魯蘭酶基因進行了異源表達，重組酶為中性I型普魯蘭酶，具有較高的耐熱性，能短時耐受淀粉糊化溫度，在直鏈淀粉、抗性淀粉生產(chǎn)和粉絲的酶法制作工藝中有一定的應(yīng)用前景。

表2 GsP與幾種芽孢桿菌來源的耐熱型普魯蘭酶的性能比較

注： “-”表示未檢測。

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Heterologous expression of pullulanase gene fromGeobacillusstearothermophilusand characterization of the recombinant enzyme

XIAO Ya-peng1, SHEN Wei2*, LI Ting-lin1, CHEN Xian-zhong1, FAN You2

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(Culture and Information Center of Industrial Microorganism of China Universities, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

GeneGsPencoding pullulanase was amplified from genome DNA ofGeobacillusstearothermophilusXQ3508 by PCR and heterologously expressed inEscherichiacoli. Despite absence of exogenous signal peptide, part of the recombinant enzyme was secreted to periplasm and culture medium. The apparent molecular weight of GsP was approximately 81.3 as measured by SDS-PAGE. Specific activity of the purified enzyme was 38.2 U/mg, and optimum pH and temperature of the recombinant enzyme were 6.5 and 60 °C, respectively. The enzyme could keep active within a short time at 70 °C. The maximal reaction velocity and Michael constant of the GsP was 0.083 μmol/min and 0.086 μmol/L, respectively. The enzyme activity of GsP could be increased by K+and Mg2+and partially inhibited by Ca2+. The GsP did not degrade amylose. High-performance liquid chromatography analysis showed that pullulan could be hydrolyzed by GsP and maltoriose was the single product. Thus, GsP belongs to type I pullulanase and it is thermostable. GsP can be applied in production of resistant starch and pure amylose.

Geobacillusstearothermophilus; heterologous expression; type I pullulanase; protein purification; enzyme property

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705006

碩士研究生(沈微副教授為通訊作者,E-mail：13921108341@163.com)。

國家863高技術(shù)研究發(fā)展計劃(2013AA102101-5)

2016-08-25，改回日期：2016-12-22