王頂柳柯張悅楊仕明馬秀嵐

1中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳科

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

3解放軍總醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所

·基礎(chǔ)研究·

120dB白噪聲對C57BL/6J小鼠聽力損失的觀察研究

王頂1柳柯2張悅3楊仕明3馬秀嵐1

1中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳科

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

3解放軍總醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所

目的觀察120dB寬頻帶白噪聲對C57BL／6J小鼠聽閾閾值、耳蝸基底膜毛細(xì)胞形態(tài)與帶狀突觸數(shù)量的影響。方法：20只聽力正常的5-6周齡C57BL／6J小鼠隨機(jī)分為四組，3組實驗組，分別為給予白噪聲后立即測量組（0d）、噪聲暴露后7天測量組（7d）、噪聲暴露后14天組（14d）；1組對照組。每組5只小鼠（n＝10），實驗組小鼠120dB白噪聲暴露2h，0d組立即測量小鼠聽閾，7天和14天應(yīng)用相同方法測量小鼠聽閾值，并計算出每只小鼠噪聲暴露前后的閾移值。各組測量閾值后立即處死取耳蝸用4%多聚甲醛固定后進(jìn)行免疫熒光染色和掃描電鏡檢查，觀察小鼠帶狀突觸與內(nèi)外毛細(xì)胞形態(tài)變化并計數(shù)。結(jié)果噪聲暴露2h后即刻組其各個頻率5只小鼠（n＝10）閾值均未引出，暴露后七天小鼠聽閾部分恢復(fù)（P<0.01）。暴露后第14天，14天組各頻率的聽閾繼續(xù)恢復(fù)，但與暴露前的差異較第7天比有所減小，但仍有統(tǒng)計學(xué)差異（所有P<0.01）。并且觀察到帶狀突觸明顯減少，掃描電鏡觀察外毛細(xì)胞纖毛有倒伏粘連。結(jié)論120dB白噪聲噪聲暴露2小時能夠造成小鼠聽力永久性閾移，外毛細(xì)胞明顯損傷，帶狀突觸數(shù)量明顯減少。

永久性閾移；帶狀突觸；噪聲性耳聾；C57BL／6J小鼠；耳聾

現(xiàn)代社會中，噪聲無處不在，人們也越來越重視噪聲對于我們生活的影響[1]。近年來由于職業(yè)因素所造成的噪聲性耳聾日益增多，在臨床上所見病例也有所增加，據(jù)研究表明，每年由于各種原因?qū)е侣犃ο陆嫡哌_(dá)到總?cè)丝诘?.4%[3]，耳聾即聽力下降已經(jīng)成為困擾人們生活的主要病因之一，其中又以噪聲性聾為首[4]。因外界噪聲導(dǎo)致聽力下降大體有兩種形式，脈沖噪聲和穩(wěn)態(tài)噪聲[5]，大多數(shù)研究者對于脈沖噪聲研究較多，其在短時間內(nèi)會造成聽力損失，伴有強(qiáng)烈的耳鳴，因此在該環(huán)境中對于人們聽力的保護(hù)尤為重要[6]。有實驗表明，長時間處在嘈雜的環(huán)境中，尤其對于廠房等高強(qiáng)度的噪聲環(huán)境下可以造成人短暫性聽力損失，而且會使人們煩躁，記憶力減退，特別是在言語辨識度上有一定程度的下降，從長遠(yuǎn)的角度看，長時間位于高強(qiáng)度嘈雜環(huán)境下工作會對人體聽力產(chǎn)生不可挽回的影響。本實驗研究小組在之前的實驗中將小鼠分別置于100dB、110dB白噪聲環(huán)境下兩小時，發(fā)現(xiàn)小鼠聽力兩小時后均有不同程度的損失，雖然在14天時均恢復(fù)到了暴露前閾值，不過ABR幅值均有不同程度的減小，并且觀察到帶狀突觸都有相應(yīng)的減少。本實驗利用120dB寬頻帶白噪聲對于聽閾正常的C57BL／6J小鼠進(jìn)行時長2小時的暴露，觀察小鼠聽力變化及恢復(fù)程度，并且對于小鼠內(nèi)外毛細(xì)胞形態(tài)及內(nèi)毛細(xì)胞附近的帶狀突觸的變化進(jìn)行觀察和研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物

本實驗選擇符合SPF級標(biāo)準(zhǔn)的雌性C57小鼠作為實驗動物，年齡為5－6周齡，并篩選ABR正常小鼠入組，共計20只。飼養(yǎng)一周后，將小鼠隨機(jī)分為3組實驗組和1組對照組，每組5只小鼠。實驗組分別為：P0(噪聲暴露后0天)P7(噪聲暴露后7天)以及P14(噪聲暴露后14天)。本實驗期間所有操作均得到解放軍總醫(yī)院倫理委員會的許可(實驗動物均由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供)。

1.2噪聲暴露

采用120dB SPL的寬頻帶白噪聲對試驗組C57BL／6J小鼠進(jìn)行噪聲暴露2小時。暴露期間,將一組小鼠（5只，n＝10）置于鼠籠中，揚(yáng)聲器在鼠籠之上。為確保鼠籠之內(nèi)聲音強(qiáng)度在1dB之內(nèi)，實驗前我們應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)聲級計對聲音進(jìn)行校準(zhǔn)，測量聲音在鼠籠中的強(qiáng)度是否符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 ABR檢測

本實驗室應(yīng)用美國TDT公司的測聽模塊設(shè)備，biosig軟件系統(tǒng)。小鼠測聽前使用5%戊巴比妥鈉(0.3m l~0.5ml/kg,腹腔注射)對小鼠進(jìn)行麻醉后插入電極，直到檢測不出波形，再增加5dB，測出可重復(fù)的波形，標(biāo)記為聽閾值[10]。

1.4耳蝸基底膜取材

各組電測聽結(jié)束后處死小鼠，眼科剪斷頭，去除腦組織，分離顳骨與耳蝸,去除蝸殼，迅速將耳蝸放入4%多聚甲醛的培養(yǎng)皿中。應(yīng)用顯微鑷在光學(xué)顯微鏡下戳破蝸頂，前庭窗和圓窗，灌流沖洗出淋巴液，4°C冰箱過夜。第二天標(biāo)本取出用10% EDTA溶液脫鈣2到3天，24小時換液一次。脫鈣完成后置于PBS培養(yǎng)皿中，從底部到頂部緩慢剝?nèi)埩糗浕奈仛?，前庭膜，蓋膜，之后分離蝸軸與基底膜。按頂中底回分為三段。

1.5免疫組化

應(yīng)用配置好的Triton100-X打孔30分鐘，含有PBS緩沖液的5%的山羊血清封閉1小時，漂洗充分后加入一抗后孵育8h漂洗加入加入二抗（驢抗羊488抗體1:500和驢抗兔543抗體1:500），室溫避光孵育1h，漂洗，甘油封片避光保存。

1.6共聚焦顯微鏡

選擇488nm、543nm以及358nm波長的激發(fā)光，熒光激發(fā)下分別顯示綠色、紅色和藍(lán)色。應(yīng)用Zeiss正置共聚焦顯微鏡，對標(biāo)本進(jìn)行層掃，以信號出現(xiàn)開始到結(jié)束，收集圖層以序號排列，疊加末置后形成最終的結(jié)果圖片。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0 IBM統(tǒng)計分析軟件，以每只小鼠噪聲暴露前后聽閾值的差值作為獨立樣本，抵消個體差異和測量誤差。對7天組和14天組應(yīng)用配對樣本t檢驗，One-way ANOVA,帶狀突觸計數(shù)結(jié)果應(yīng)用t檢驗，P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABR結(jié)果噪聲暴露結(jié)束后0d組5只小鼠click及各頻段純音聽閾閾值未引出。7d時聽閾有所恢復(fù)，click平均閾移值在80dB，暴露后14天時聽閾閾移值停留在70dB。各頻段純音聽閾閾值均有明顯提高。對暴露后7天及14天各頻率的聽閾變化進(jìn)行One-way ANOVA分析，在7天、14天，32kHz處閾移最小，且明顯低于Click、4kHz、8kHz和16kHz處的閾移，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，0.05），表明高頻段受噪聲影響較小。（見表1）

2.2掃描電鏡結(jié)果根據(jù)掃描電鏡結(jié)果分析，0d組中回部分即有部分外毛細(xì)胞的纖毛倒伏和粘連，7天和14天依然有外毛細(xì)胞的缺失，有兩種情況，可能是凋亡，也有可能是缺失，這些都與聽力閾值的全面提高有著必然的聯(lián)系。噪聲暴露后內(nèi)毛細(xì)胞電鏡中觀察無明顯變化。（見圖1）

圖1 可見噪聲暴露后毛細(xì)胞纖毛嚴(yán)重缺失和脫落，內(nèi)毛細(xì)胞未見明顯缺失，細(xì)胞纖毛完整。箭頭所指是外毛細(xì)胞纖毛缺失脫落的位置?？梢娫肼暠┞逗?4天時外毛細(xì)胞纖毛倒伏融合。Fig.1 It’s seriously damaged and got loss about ciliums of OHC after noise exposure,but the damage of IHC isnotobvious.No deficiency is found in stereocilia of cell.The location of the arrow is the place where the OHC fall off.Cilia of OHC is lodged and fused in 14 daysafternoiseexposure.

2.3免疫組化結(jié)果Ctbp2和GluR2/3染色后可明顯觀察到Ctbp2標(biāo)記的帶狀突觸和GluR2/3標(biāo)記的突觸后遞質(zhì)在實驗前后的變化，并將得到的組圖結(jié)果進(jìn)行疊加后進(jìn)行了三維重建，并定量計數(shù)頂中底回內(nèi)毛細(xì)胞附近的帶狀突觸數(shù)量的變化（見圖2），其得到的結(jié)果與聽力的結(jié)果相一致，0天最少，7天和14天有所恢復(fù)，但與對照組相比均有較大的差距。(**P<0.01)（見圖3）

圖2 分別展示了對照組、即刻組、第七天組、第十四天組綠色的突觸前遞質(zhì)，紅色的突觸后遞質(zhì)，以及橙色的完整突觸的數(shù)量關(guān)系，可見噪聲暴露后突觸的數(shù)量有逐漸恢復(fù)的趨勢，說明了突觸的可塑性和自我修復(fù)性。Fig.2 green stands for presynaptic transm itter,red stands for postsynaptic transmitterand orange stands for themerged synaptic.We select three time points and record the number of RS respectively.The result shows that the number of synaptic has a tendency to recover gradually after noise exposure, what illustratesplasticity of the RS.

圖3 可見突觸前與突觸后之間數(shù)量上無明顯差異（P> 0.05），噪聲暴露后即刻組突觸數(shù)量明顯下降，七天和十四天突觸數(shù)量呈逐漸增多的趨勢。與對照組比較即刻組，7天組和十四天組具有統(tǒng)計學(xué)意義（**P<0.01,*P<0.05）Fig.3 the result shows that the number of presynaptic and postsynaptic is no difference(P>0.05),the number of stat. group was obviously down,7days and 14days groups are increasing gradually.It has statistical significance comparing stat.group,7days group,14days group w ith the control group (**P<0.01,*P<0.05)

表1 120dB白噪聲2h后各實驗組閾移值結(jié)果Table 1 Resultsof the threshold shiftafter120 dBwhite noise for2 hours in each group

3 討論

噪聲性耳聾如今越來越受到研究者的關(guān)注，其早期表現(xiàn)為聽覺疲勞，在脫離噪聲環(huán)境后可以逐漸緩解，長時間暴露則難以恢復(fù)，最終導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾。在本實驗中小鼠聽力于噪聲暴露后14天停留在70dB左右，本研究小組根據(jù)liberman實驗室小鼠造模方法，在100dB、110dB中得到了相似的結(jié)果[7]，即14天小鼠聽力完全恢復(fù)，不過在本實驗中120dB暴露2h后C57BL／6J小鼠聽閾顯著提高，于14d時聽閾停留70dB左右，在實驗結(jié)果中中低頻聽力下降較重而高頻聽力下降相對較輕，這于liber?man的實驗結(jié)果有所不同，其高頻聽力下降明顯，有研究表明，不同種系的小鼠對于不同頻段的純音敏感性不同，即相同頻段其ABR幅值亦不相同[8-10]。

根據(jù)此前研究小組結(jié)果，可以初步判斷在2小時時長的噪聲暴露中，120dB白噪聲即可導(dǎo)致外毛細(xì)胞纖毛受損，形成永久性閾移[11]。小鼠頂回毛細(xì)胞纖毛形態(tài)細(xì)長可能容易形成缺損，底回外毛細(xì)胞纖毛形態(tài)短粗不易脫落粘連，纖毛形態(tài)上的差異可能導(dǎo)致缺損嚴(yán)重程度的不同；有研究表明，不同種系動物對于聲音頻率的敏感程度不同，因此對于寬頻譜的白噪聲而言，噪聲暴露后造成各頻率閾移值明顯不同。這也印證了本實驗聽力學(xué)檢測的結(jié)果。

除此之外，噪聲暴露后所測量的ABR幅值極其混亂，未見正常的波峰波谷，無法測量其閾值，在liberman實驗結(jié)果中有提到強(qiáng)噪聲對中樞神經(jīng)的影響，而且這種損傷存在其不可逆性[12-14]。我們對噪聲暴露前和暴露后各時間點的小鼠進(jìn)行耳蝸取材后對其螺旋神經(jīng)節(jié)與傳入神經(jīng)之間的帶狀突觸進(jìn)行Ctbp2和GluR2/3標(biāo)記，免疫熒光結(jié)果顯示噪聲暴露后帶狀突觸信號計數(shù)明顯下降，7天最低，在14天時有所恢復(fù)。這說明帶狀突觸具有自我修復(fù)性和自我保護(hù)機(jī)制[15-17]。

本研究中，在實驗研究小組的基礎(chǔ)上對C57BL／6J小鼠采用120dBSPL的寬頻帶白噪聲暴露2小時，建立了一種C57BL／6J小鼠的永久性閾移模型，并且對該模型的聽力變化特點進(jìn)行了研究。為今后對小鼠帶狀突觸的研究和內(nèi)外毛細(xì)胞的形態(tài)變化奠定了實驗基礎(chǔ)。該實驗還有一些不足之處，如未設(shè)置更長時程的實驗組，也沒有對小鼠耳蝸外毛細(xì)胞缺失進(jìn)行凋亡染色，以確定小鼠噪聲暴露后是否啟動了外毛細(xì)胞凋亡的機(jī)制，因此在實驗結(jié)果上還有許多可以改進(jìn)補(bǔ)充的地方。在今后的研究中，外毛細(xì)胞凋亡機(jī)制及帶狀突觸的可塑性將會是本實驗的重點研究方向。

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Effectsof high levelwhitenoiseexposure on hearing function in C57BL/6JM ice

Wang Ding1,Liu Ke2,Zhang Yue3,Yang Shiming3,Ma Xiulan1
1DepartmentofOtology,Shengjing HospitalofChina MedicalUniversity,Shenyang 110004,China
2DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,Beijing Friendship HospitalofCapitalMedicalUniversity
3DepartmentofOtolaryngology Head and Neck surgery,InstituteofOtolaryngology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing 100853,China

MAXiulan Email:maxl1@sj-hospital.org

Objective To investigate changesof hearing threshold,morphology and the ribbon synapses in the cochlear basilarmembrane after 2 hours exposure to white noise at 120 dB SPL in C57BL/6Jm ice.Methods Twenty C57BL/6Jmicew ith normalauditory thresholdswere random ly divided into four groups(n=5,10 ears,in each group). Animals in three groups(experiment groups)were exam ined at 0 day,7 days and 14 days after noise exposure.One group was used as control.Immunofluorescent staining and scanning electronm icroscopy(SEM)exam ination focusing onmorphology of OHCs and ribbon synapseswere conducted after auditory brainstem response(ABR)testing.Result Auditory thresholds could notbe detected at0 day after noise exposure.Compared w ith the control,ABR thresholds remained elevated at7 day afternoise exposure(P<0.01).ABR thresholds at14 days afternoise exposurewere better than at7 days after,although stillworse than the control(P<0.01).There was an obvious decrease in the number of ribbon synapsis.Adhesion and disarray of OHC stereociliawere seen on SEM.Conclusions Exposure to white noise at120 dB SPL for2 hours can lead to permanent threshold shift(PTS)inmice,causing severe damage to OHC and decreaseof ribbon synapses.

PTS；Ribbon synapses；NIHL；C57BL/6Jmice；Hearing loss

R764

A

1672-2922（2017）02-217-5

2017-01-10審核人：于寧）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.02.015

王頂，碩士研究生,研究方向:噪聲性耳聾

馬秀嵐,Email:maxl1@sj-hospital.org