鄭暉 楊柳英 張娟 郭小文 陶濤 尉明洋 施冬生 馬千

神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角Sirt1與miR-34b表達(dá)的變化

鄭暉 楊柳英 張娟 郭小文 陶濤 尉明洋 施冬生 馬千

目的 研究Sirt1與miR-34b在神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角中表達(dá)變化的臨床意義。方法 將14只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）和坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組（CCI組），每組7只。于模型建立前1d及術(shù)后第7、14天，測定大鼠機(jī)械縮足反射閾值（MWT）和熱縮足反射潛伏期（TWL）。術(shù)后第14天取大鼠L4～5節(jié)段脊髓進(jìn)行病理學(xué)檢查，HE染色后觀察脊髓背角運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)量變化。real-time PCR檢測脊髓背角內(nèi)Sirt1與miR-34b的表達(dá)，Western blot測定大鼠脊髓背角內(nèi)Sirt1、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）的表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)MWT和TWL驗(yàn)證，大鼠CCI神經(jīng)病理性疼痛模型建立成功。HE染色顯示，與Sham組比較，CCI組大鼠在手術(shù)后7、14d脊髓背角神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（均P＜0.05）。real-time PCR結(jié)果顯示，與Sham組相比，CCI組Sirt1表達(dá)降低，miR-34b表達(dá)升高（均P＜0.05）。Western blot顯示Sirt1與CREB表達(dá)降低，pCREB與BDNF表達(dá)增加。結(jié)論 Sirt1與miR-34b的表達(dá)變化可能參與坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛的形成和維持。

神經(jīng)病理性疼痛 CCISirt1 miR-34b 脊髓背角

神經(jīng)病理性疼痛是由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷或產(chǎn)生病變而導(dǎo)致的疼痛，該疼痛具有長效性[1]。依據(jù)疼痛發(fā)生的原因，臨床上常見的類型包括：糖尿病性神經(jīng)病變、皰疹病毒感染后的神經(jīng)痛、三叉神經(jīng)痛、中樞神經(jīng)性的中風(fēng)后疼痛以及脊髓損傷性疼痛，而創(chuàng)傷和手術(shù)后神經(jīng)病變及放射性病變也是比較常見的類型[2]。沉默信息調(diào)節(jié)因子-2（silencing information regulator 2，Sir2）相關(guān)酶1（silent mating type information regulation 2 homolog 1，Sirt1）作為一種核蛋白，是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC），參與生命系統(tǒng)中的多種復(fù)雜過程，通過脫去乙?；阴；M蛋白和其他特定的底物，促進(jìn)脊髓Sirt1激活，可以有效減輕神經(jīng)性疼痛[3]。已有研究表明，通過靶向作用于Sirt1參與的通路，可以有效緩解坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷（CCI）大鼠的神經(jīng)病理性疼痛[4]。miRNA是目前發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后對基因表達(dá)調(diào)控起決定作用。miRNA與多種疼痛疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，已有研究發(fā)現(xiàn)在多個神經(jīng)組織中，miRNA參與炎性肌肉痛和外周神經(jīng)痛的發(fā)生，且包括miR-34b等多種miRNA的表達(dá)有顯著改變[5-6]。本研究利用CCI模型鼠，觀察干預(yù)前后大鼠脊髓背角Sirt1與miR-34b表達(dá)是否也隨著大鼠神經(jīng)損傷發(fā)生改變，以探討兩者在神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角中表達(dá)變化的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器 本實(shí)驗(yàn)中所有試劑均為國產(chǎn)分析純，Sirt1等抗體均購自Abcam公司，辣根過氧化酶二抗均購自北京中山金橋公司，PCR相關(guān)試劑購自大連寶生物公司，real-time PCR儀器購自ABI公司，Western blot全套設(shè)備購自Bio-Rad公司，恒溫箱（HWS型）購買自自寧波江南儀器廠。

1.2 動物 健康雄性SD大鼠14只，體重220～260g，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，所有動物符合一級質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。動物隨機(jī)分為CCI組與假手術(shù)組（Sham組），每組7只。兩組大鼠均飼養(yǎng)在安靜、通風(fēng)及空氣過濾系統(tǒng)良好的環(huán)境中，控制溫度20℃，濕度50%，12h/ 12h交替關(guān)閉或者開啟燈光，根據(jù)情況更換墊料和水。

1.3 模型制作 按照Bennett和Xie等[7]方法制作CCI大鼠模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛30～40mg/kg。在無菌條件下沿左下肢背側(cè)部縱向切開，暴露出股二頭肌，鈍性分離開肌肉組織，暴露坐骨神經(jīng)后用神經(jīng)剝離子輕輕將其與周圍組織用絲線間隔作1mm結(jié)扎4道，逐層進(jìn)行縫合創(chuàng)口。術(shù)后3d檢測大鼠痛閾降低30%，出現(xiàn)術(shù)側(cè)爪內(nèi)收、后足輕度外翻和跛行，說明模型成功可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。Sham組不對神經(jīng)進(jìn)行結(jié)扎。觀察大鼠創(chuàng)口有無感染，術(shù)側(cè)肢體有無自噬現(xiàn)象。

1.4 行為學(xué)檢測 術(shù)前1d及術(shù)后7、14d測定，每次測定選擇當(dāng)天11:00～14:00，室溫25℃。熱縮足反射潛伏期（thermal paw withdrawal threshold，TWL）的測定：選用336爪/尾刺激痛覺測試計(jì)檢測大鼠TWL。參數(shù)設(shè)置：加熱頭在空閑時(shí)激光發(fā)射強(qiáng)度為20%；加熱頭在工作時(shí)激光發(fā)射強(qiáng)度為60%；切斷時(shí)間25s，防止對動物造成損傷；觸發(fā)時(shí)溫度30℃。分別將大鼠置于實(shí)驗(yàn)臺上，安靜片刻之后，使用加熱頭照射大鼠術(shù)側(cè)足底部，此刻出現(xiàn)抬腿回避時(shí)間為記為TWL。刺激間隔5min/次，可測3次取其平均值。機(jī)械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的測定：將實(shí)驗(yàn)大鼠置于透明的有機(jī)玻璃箱中，底為1cm×1cm的鐵絲網(wǎng)，測試前使大鼠適應(yīng)15min。使用測痛計(jì)，由下往上垂直刺激大鼠術(shù)側(cè)足底光滑部分皮膚，逐漸加大刺激強(qiáng)度，記錄足回縮反應(yīng)（如舔足、甩腿等）時(shí)的刺激強(qiáng)度值為MWT，刺激間隔10s/次，檢測5次取其平均值。

1.5 病理學(xué)檢查 造模后14d將大鼠用1%戊巴比妥鈉60mg/kg進(jìn)行麻醉，升主動脈插管，通過升主動脈灌注預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液，然后灌注4%多聚甲醛溶液。取L4～5脊髓節(jié)段后使用4%多聚甲醛溶液固定24～48h，經(jīng)過漂洗、脫水，石蠟包埋后切片，HE染色，每組隨機(jī)各取3張切片光鏡下觀察脊髓神經(jīng)元胞體數(shù)。

1.6 real-time PCR檢測Sirt1與miR-34b表達(dá) 腹腔注射10%水合氯醛麻醉處死大鼠，用解剖鉗及鑷子等暴露并分離出大鼠L4～5脊髓背角組織，將分離出的組織放入凍存管后保存于液氮中備用。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)從液氮中取出組織，置于研缽中并且保持液氮存在的環(huán)境下充分研磨。然后加入分離緩沖液及10%SDS混勻，并加入蛋白酶K置于37℃恒溫1～2h，加入0.9%氯化鈉溶液后離心，取上清液，采用氯仿-異戊醇法提取DNA。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min，然后依次94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共擴(kuò)增循環(huán)30次，最后72℃延伸6min，具體引物及酶的使用見說明書。試驗(yàn)中涉及到引物：18SrRNAsense5′-ATTCCGATAACGAACGAGAG-3′；anti-sense5′-GGCATCACAGACCTGTTATTG-3′。Sirt1的 sense 5′-GGATCCTTCATTTATCAGAGTTGCCACC-3′；anti-sense 5′-CTTCGAGGTTCTTCTAAACTTGGACTCTGG-3′。miR-34b的sense 5′-TTTAGTTACGCGTGTTGTGC-3′；anti-sense 5′-ACTACAACTCCCGAACGATC-3′。

1.7 Western blot檢測Sirt1、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）、pCREB和腦源性營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）表達(dá) 獲取的組織置于液氮中保存，取出組織后在液氮環(huán)境下研磨，加入1ml裂解液混勻，室溫靜置1h，15 000g離心1h，取上清液以BCA法測定蛋白濃度后，經(jīng)過上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，然后加入10%BSA后室溫封閉1h，加入一抗Sirt1、CREB、pCREB、BDNF和β-actin，在4℃孵育過夜。洗去一抗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG的二抗，室溫孵育2h后，采用ECL熒光顯色，最后將顯色后的蛋白條帶放入Syngene G:BOX成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，然后對拍照后的條帶圖進(jìn)行灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，采用Image J軟件對Western blot條帶的灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠不同時(shí)點(diǎn)行為學(xué)測試結(jié)果的比較 在CCI模型制備成功后，觀察大鼠創(chuàng)口無感染，術(shù)側(cè)肢體沒有自噬現(xiàn)象。兩組大鼠術(shù)前1d TWL和MWT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中Sham組大鼠在術(shù)后未觀察到運(yùn)動障礙和側(cè)抓內(nèi)收等，并且不同時(shí)點(diǎn)其TWL和MWT無差異。CCI組大鼠術(shù)后7、14d的TWL 和MWT均比術(shù)前1d低（P＜0.05），同時(shí)與Sham組相比，CCI組大鼠的TWL和MWT明顯降低（均P＜0.05），說明CCI大鼠模型制作成功，詳見表1、2。

表1 兩組大鼠不同時(shí)點(diǎn)TWL的比較（min）

表2 兩組大鼠不同時(shí)點(diǎn)MWL的比較

2.2 兩組大鼠神經(jīng)元數(shù)量的比較 經(jīng)過HE染色后，在顯微鏡下觀察CCI組大鼠與Sham組大鼠L4～5脊髓背角神經(jīng)元數(shù)量，結(jié)果顯示在手術(shù)14d后，CCI組大鼠的神經(jīng)元數(shù)量為（120.9±6.0）個，明顯低于Sham組的（163.0±5.1）個，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 兩組大鼠Sirt1與miR-34b表達(dá)的比較 經(jīng)過real-time PCR檢測結(jié)果顯示，與Sham組相比，CCI組Sirt1表達(dá)明顯降低，miR-34b表達(dá)明顯升高（均P＜0.05），詳見表3。

表3 兩組大鼠Sirt1與miR-34b表達(dá)的比較

2.4 兩組大鼠Sirt1、CREB、pCREB和BDNF表達(dá)的比較 CCI組大鼠的Sirt1與CREB表達(dá)均明顯降低，但pCREB及BDNF表達(dá)升高（P＜0.05），詳見圖1。

圖1 兩組大鼠Sirt1、CREB、pCREB和BDNF表達(dá)的變化（與Sham組比較，*P＜0.05）

3 討論

在本研究中，通過對兩組大鼠的檢測發(fā)現(xiàn)，CCI組大鼠第7、14天TWL和MWT明顯低于術(shù)前1d。在14d時(shí)取各組大鼠的L4～5段脊髓背角，通過對部分組織的HE染色后對神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，CCI大鼠在手術(shù)造成神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)14d后，神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，這一現(xiàn)象與疼痛的發(fā)展相一致；在對脊髓內(nèi)Sirt1與miR-34b的real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，CCI組的Sirt1表達(dá)降低，miR-34b的表達(dá)增加，說明這兩個基因與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展存在潛在的關(guān)系；隨后，筆者通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞內(nèi)Sirt1相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCI組大鼠Sirt1表達(dá)與real-time PCR結(jié)果一致，呈現(xiàn)出降低態(tài)勢，而CREB也出現(xiàn)表達(dá)降低，但是其蛋白的磷酸化水平增加，BDNF表達(dá)也增加。這些基因及蛋白在Sham組與CCI組大鼠之間的差異，說明其與神經(jīng)病理學(xué)疼痛的形成及發(fā)展密切相關(guān)。

當(dāng)前針對神經(jīng)病理性疼痛研究還多依賴于動物模型，雖然當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛嬖诓蛔?，但依然能為認(rèn)識和探究人類的神經(jīng)病理性疾病提供幫助。Bennett和Xie 在1988年首次成功建立了CCI模型[7-8]，該模型易制作且在術(shù)后14d痛反應(yīng)達(dá)到頂峰，所以在目前國際上依然被廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)這一經(jīng)典方法制作大鼠CCI模型，通過檢測TWL和MWT出現(xiàn)明顯下降，并且觀察到CCI大鼠爪內(nèi)收并且有輕度的外翻，表明我們的動物模型可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

神經(jīng)元與疼痛存在密切關(guān)系[9]，當(dāng)具有抑制作用的神經(jīng)元數(shù)量減少，可能會造成脊髓背角的傷害性神經(jīng)元的興奮性增高，發(fā)生痛覺過敏現(xiàn)象[10]；另一方面是神經(jīng)元的自發(fā)性放電，通過打開或者關(guān)閉相應(yīng)的離子通道從而實(shí)現(xiàn)對痛覺的傳遞[9]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CCI組大鼠在14d后L4～5段脊髓背角內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，說明CCI大鼠神經(jīng)元數(shù)量的減少可能會造成神經(jīng)病理性疼痛傳遞變化。Zhao等[5]對miRNA在炎性痛發(fā)病機(jī)制中的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA能夠調(diào)控炎性痛相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CCI大鼠脊髓背角miR-34b水平下調(diào)，由于miRNA的作用是抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯，其對應(yīng)的靶基因CREB表達(dá)增加，這與之前的研究相符，表明miRNA與疼痛發(fā)生和維持密切相關(guān)。Sirt1在腦神經(jīng)元中有廣泛分布，在誘導(dǎo)基因沉默中發(fā)揮重要作用，能夠在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)間往返[11]，參與了神經(jīng)元細(xì)胞的程序性死亡和能量代謝[12-13]。CREB和BDNF的啟動子Ⅰ和Ⅳ結(jié)合，兩者結(jié)合的結(jié)果是增加BDNF的轉(zhuǎn)錄，但如果Sirt1催化活性缺乏則沒有這種轉(zhuǎn)錄增加的作用，在動物海馬Sirt1發(fā)生催化活性缺乏的突變小鼠，其CREB 和BDNF啟動子的結(jié)合也有所下降，而CREB又能夠調(diào)控神經(jīng)突觸的傳遞功能[14]。這些蛋白的變化，最終導(dǎo)致了神經(jīng)病理性疼痛傳遞的發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建大鼠的CCI模型，觀察脊髓背角神經(jīng)元的變化，然后再通過分子生物學(xué)方法對動物脊髓背角組織內(nèi)的miR-34b、Sirt1、CREB及BDNF等檢測，初步探究了神經(jīng)病理性損傷相關(guān)的分子變化，這些改變將為今后對神經(jīng)損傷的研究提供重要的理論依據(jù)，為相關(guān)藥物的研發(fā)提供幫助。

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Expression of Sirt1 and miR-34b in spinal dorsal horn of rats with neuropathic pain

ZHENG Hui,YANG Liuying,ZHANG Juan,etal.Department of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310006,China

Neuropathic pain Chronic constriction injury Sirt1 miR-34b Dorsal horn of spinal cord

2016-08-02）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2015ZB052）

310006 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科

鄭暉，E-mail：huizheng2001@sina.com

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of Sirt1 and miR-34b in spinal cord of rats with neuropathic pain. Methods Fourteen male SD rats were randomly divided into sham operation group and sciatic nerve chronic constriction injury (CCI)group with 7 rats in each group.The mechanical withdrawal threshold (MWT)and thermal paw withdrawal threshold (TWL)of rats were determined at 1 d before and 7,14d after establishment of animal model.At d14 of CCI operation the animals were sacrificed and L4～5segment of spinal cord was obtained,and the morphological changes of motor neurons in the dorsal horn of the spinal cord were observed with HE staining.Real-time PCR was used to detect the expression of Sirt1 and miR-34b in the dorsal horn of the spinal cord,and the protein expression of Sirt1,BDNF and CREB in rat spinal dorsal horn was determined by Western blot. Results The rat model of CCI were successfully established as tested by MWT and TWL. Histopathological observation showed that the number of spinal dorsal horn neurons was significantly decreased in CCI group after 7d and 14d (P＜0.05).Real-time PCR showed that Sirt1 expression was decreased and miR-34b expression was increased in CCI group compared with the control group (P＜0.05).Western blot showed that the expression of Sirt1 and CREB decreased,and the expression of pCREB and BDNF increased. Conclusion The expression changes of Sirt1 and miR-34b may be involved in the formation and maintenance of neuropathic pain induced by chronic constriction injury of sciatic nerve.