葉燕彬 羅玉 鄺立鵬 安榮澤

1.惠東縣人民醫(yī)院骨科，廣東 惠州 516000 2.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)臨床醫(yī)學(xué)系，廣東 珠海 519000 3.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院骨科二區(qū)，廣東 珠海 519000

鐵離子是細(xì)胞必需的元素之一，參與多種細(xì)胞DNA合成、氧轉(zhuǎn)運、細(xì)胞呼吸鏈氧化還原反應(yīng)等；正常鐵代謝構(gòu)成機體的鐵穩(wěn)態(tài)，當(dāng)鐵穩(wěn)態(tài)發(fā)生異常時，機體各類系統(tǒng)都會出現(xiàn)相應(yīng)的代謝紊亂。近年來研究發(fā)現(xiàn)[1,2]，鐵蓄積不僅與血液系統(tǒng)疾病、腦鐵代謝有關(guān)，而且與絕經(jīng)后骨代謝異常密切相關(guān)。多項研究表明[3-5]，鐵蓄積狀態(tài)可能促進(jìn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展，而減少體內(nèi)鐵含量是預(yù)防鐵蓄積所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松的一種方法。查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)外尚未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的鐵蓄積狀態(tài)骨質(zhì)疏松動物模型，本研究旨在通過去卵巢結(jié)合蔗糖鐵誘導(dǎo)家兔鐵蓄積狀態(tài)骨質(zhì)疏松模擬女性絕經(jīng)后鐵蓄積骨質(zhì)疏松，以期為有關(guān)鐵蓄積狀態(tài)骨質(zhì)疏松的實驗研究提供動物模型基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

1.1.1實驗動物：5月齡國內(nèi)培育的普通級新西蘭雌兔30只，體重2.3-2.5 kg，全部購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：[SCXK (粵) 2014-0035]。

1.1.2主要試劑與器材：常規(guī)消毒物品、生理鹽水、慶大霉素、無菌紗布及敷料、縫合針及線、手術(shù)刀、持針器、血管鉗、腹腔拉鉤、普通眼科手術(shù)器械、鑷子等，以上器材均由我院動物實驗中心提供；兔血清鐵蛋白ELISA試劑盒(Bio-Swamp)、兔血清1型膠原羥基末端肽(Type 1 collagen carboxy-terminal peptide，CTX)ELISA試劑盒(Bio-Swamp)、兔血清1 型前膠原氨基末端肽(Type 1 procollagen amino-terminal peptide，P1NP)ELISA試劑盒(Bio-Swamp)，以上試劑盒由武漢貝茵萊生物科技有限公司提供；氨基甲酸乙酯(烏拉坦)，由上海博耀生物科技有限公司提供；蔗糖鐵注射液，由廣東天普生化醫(yī)藥有限公司提供；美國Thermo-ST16離心機，由上海仁器儀器公司提供。

1.1.3主要試劑的配制：20%烏拉坦溶液(麻醉劑)：取20 g烏拉坦晶體加入0.9%氯化鈉溶液定容至100 mL。儲存在棕色瓶中避光保存，高壓滅菌，限1周內(nèi)使用。蔗糖鐵溶液：在 0.9%氯化鈉溶液50 mL中加入200 mg蔗糖鐵注射液，充分混勻，限24 h內(nèi)使用。

1.2 動物分組和造模

1.2.1動物分組：將30只雌性5月齡普通級新西蘭兔，隨機分為3組：對照組10只、去勢組10只、鐵蓄積組10只。每組分別于造模前1天行耳緣靜脈采血3ml，3 000 r/min離心5 min后收集上清液，置于-80 ℃超低溫冰箱儲存，待后期行ELISA檢測血清P1NP，CTX及血清鐵蛋白水平；并行腰椎骨密度測量。

1.2.2造模：去勢組和鐵蓄積組以20%烏拉坦溶液8-12 mL經(jīng)家兔耳緣靜脈注射麻醉，在無菌條件下由恥骨聯(lián)合上正中切口切開腹腔，手術(shù)切除雙側(cè)卵巢(見圖1)，關(guān)閉腹腔；對照組打開腹腔找到卵巢后切除卵巢周圍少許脂肪即關(guān)閉腹腔。術(shù)后將動物飼養(yǎng)在溫度20～25 ℃，相對濕度為40%～70%的環(huán)境中。術(shù)后連續(xù)3天肌注慶大霉素1萬U/kg，每天2次。術(shù)后定量喂食兔糧 (50 g/d)，自由飲水。

1.3 注射蔗糖鐵

1周后鐵蓄積組經(jīng)耳緣靜脈注射蔗糖鐵(15 mg/kg，1次/周，共12周)。對照組和去勢組以同樣方式和頻次給予等量生理鹽水注射。

1.4 家兔耳緣靜脈采血

所有組分別于術(shù)后4、8、12、16、20、24周進(jìn)行耳緣靜脈采血3 mL，3 000 r/min離心5 min后收集上清液，置于-80 ℃超低溫冰箱儲存，后期行ELISA檢測血清P1NP，CTX及血清鐵蛋白水平。

1.5 腰椎骨密度測量

所有組分別于術(shù)后4、8、12、16、20、24周進(jìn)行腰椎骨密度測量：所有動物以8-10 mL/kg耳緣靜脈注射20%烏拉坦溶液麻醉后，俯臥位平置于雙光能X線骨密度儀上，運用計算機軟件自帶的小動物模式，測量腰椎骨密度(見圖2)。

圖1 卵巢切除術(shù)Fig.1 Ovariectomy

圖2 家兔腰椎骨密度測量Fig.2 Lumbar spine bone mineral density measurement in rabbits

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 動物一般情況

造模后第二天各組動物均恢復(fù)正?；顒?，飲食正常。一周后手術(shù)切口愈合良好，無紅腫、傷口裂開等現(xiàn)象，所有動物于術(shù)后10天拆除縫線。所有動物注射蔗糖鐵后飲食、活動均正常，未出現(xiàn)昏迷、抽搐、精神萎靡、呼吸急促等不良反應(yīng)或致死的情況。

2.2 造模后不同時間點各組鐵蓄積情況及骨質(zhì)疏松指標(biāo)的觀察

2.2.1造模后不同時間點各組血清鐵蛋白水平變化的觀察

鐵蓄積組血清鐵蛋白水平在造模后8周、12周、16周、20周及24周均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著造模時間的延長，血清鐵蛋白水平呈上升趨勢；與對照組比較，去勢組血清鐵蛋白水平在造模后第12周才開始出現(xiàn)上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著造模時間的延長，血清鐵蛋白水平呈上升趨勢，但血清鐵蛋白水平及上升趨勢均明顯低于鐵蓄積組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

2.2.2造模后不同時間點各組血清P1NP，CTX水平變化的觀察

與對照組比較，鐵蓄積組與去勢組血清P1NP，CTX水平均在造模后第12周開始出現(xiàn)上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著造模時間的延長，兩組血清P1NP，CTX水平在造模后16周、20周及24周均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；鐵蓄積組血清P1NP，CTX水平在造模后20周及24周均明顯高于去勢組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

2.2.3造模后不同時間點各組腰椎骨密度的觀察

與對照組比較，鐵蓄積組與去勢組腰椎骨密度均在造模后第16周開始出現(xiàn)下降，且隨著造模時間的延長，兩組腰椎骨密度呈下降趨勢，在造模后20周及24周均明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；鐵蓄積組與去勢組腰椎骨密度丟失百分率(%)均在造模后第24周超過同期對照組的25%(33.72%、25.92%)。鐵蓄積組腰椎骨密度在造模后20周及24周均明顯低于去勢組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但造模后第20周鐵蓄積組腰椎骨密度丟失百分率未超過同期對照組的25%(見表3、4、5)。

時間點對照組(n=10)去勢組(n=10)鐵蓄積組(n=10)造模前1天116.90±9.89117.81±9.20116.70±9.43造模后4周117.45±10.98119.23±10.87120.28±10.50造模后8周118.86±10.70127.87±7.87254.55±20.75#▲造模后12周120.66±9.68165.97±15.11#335.74±29.87#▲造模后16周117.54±8.88187.06±16.26#377.82±32.97#▲造模后20周126.66±9.33196.51±20.39#399.48±30.49#▲造模后24周124.30±10.81210.90±20.24#411.55±31.51#▲

注：▲與去勢組比較P<0.05#與對照組比較P<0.05。
Note：▲Compared with the ovariectomy group,P<0.05;#compared with the control group,P<0.05.

時間點對照組(n=10)去勢組(n=10)鐵蓄積組(n=10)P1NPCTXP1NPCTXP1NPCTX造模前1天5.92±0.606.63±0.375.84±0.676.71±0.195.87±0.626.73±0.23造模后4周5.83±0.626.49±0.335.79±0.626.78±0.305.78±0.536.54±0.44造模后8周5.76±0.646.53±0.305.93±0.446.68±0.375.85±0.426.76±0.35造模后12周5.87±0.466.62±0.267.77±0.64#7.30±0.24#7.97±0.67#7.44±0.38#造模后16周5.93±0.386.71±0.247.90±0.40#8.19±0.19#8.27±0.79#8.41±0.32#造模后20周5.95±0.336.82±0.199.32±0.49#10.59±0.57#10.77±1.18#▲11.86±1.43#▲造模后24周5.99±0.316.86±0.2710.99±0.75#12.49±0.64#13.23±0.73#▲14.78±0.77#▲

注：▲與去勢組比較P<0.05#與對照組比較P<0.05。
Note：▲Compared with the ovariectomy group,P<0.05;#compared with the control group,P<0.05.

時間點對照組(n=10)去勢組(n=10)鐵蓄積組(n=10)造模前1天287.62±28.84288.43±27.95287.55±27.53造模后4周286.60±31.72290.09±35.95290.64±30.24造模后8周285.74±30.90287.40±32.08286.46±30.32造模后12周290.82±36.50285.10±32.54283.43±29.47造模后16周291.90±33.82260.44±34.21#249.26±24.34#造模后20周282.27±35.62245.32±32.25#221.14±22.84#▲造模后24周282.50±33.50209.27±35.65#187.25±18.46#▲

注：▲與去勢組比較P<0.05#與對照組比較P<0.05。
Note：▲Compared with the ovariectomy group,P<0.05;#compared with the control group,P<0.05.

表4 造模后16、20、24周鐵蓄積組腰椎骨密度丟失百分率(%)Table 4 The percentage of lumbar spine bone mineral density loss in the iron accumulation group at 16, 20, 24 weeks after ovariectomy

注：▲腰椎骨密度丟失百分率超過同期對照組的25%。
Note：▲The bone loss rate was 25% greater compared with the control group.

表5 造模后16、20、24周去勢組腰椎骨密度丟失百分率(%)Table 5 The percentage of lumbar bone mineral density loss in the ovariectomy group at 16, 20, 24 weeks after ovariectomy

注：▲腰椎骨密度丟失百分率超過同期對照組的25%。
Note：▲The bone loss rate was 25% greater compared with the control group.

3 討論

研究表明[6]，氧化應(yīng)激反應(yīng)在鐵蓄積導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的機制中具有重要作用。Almeida[7]等研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激反應(yīng)可以影響成骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路：其產(chǎn)生的活性氧分子可激活轉(zhuǎn)錄因子O亞家族(Forkhead Box O，F(xiàn)OXO)，后者可與“T”細(xì)胞因子/淋巴樣增強因子(TCF/LEF)競爭性結(jié)合β-catenin分子，從而抑制經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路，抑制骨形成，促進(jìn)骨吸收，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。Liu等[5]的研究中，切除大鼠卵巢建立骨質(zhì)疏松模型，然后給予去勢后大鼠口服鐵螯合劑降低鐵含量，9周后觀察其對骨質(zhì)疏松模型形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未口服鐵螯合劑大鼠的骨密度顯著低于口服鐵螯合劑的大鼠。該研究表明：鐵蓄積狀態(tài)可能促進(jìn)去勢后動物模型骨質(zhì)疏松的發(fā)展。

近年來研究發(fā)現(xiàn)[1,8]，鐵蓄積與絕經(jīng)后骨代謝異常密切相關(guān)，健康絕經(jīng)后女性骨密度下降與血清鐵蛋白水平存在相關(guān)性，主要導(dǎo)致絕經(jīng)后成骨細(xì)胞功能抑制，骨形成下降，且與雌激素缺乏導(dǎo)致的絕經(jīng)后破骨細(xì)胞活躍，骨吸收增強相互獨立，故鐵蓄積是加速骨量丟失，促進(jìn)骨質(zhì)疏松發(fā)展的一個獨立危險因素；張林林等[2]的研究還發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后髖部骨質(zhì)疏松性骨折患者普遍存在鐵蓄積現(xiàn)象，表明鐵蓄積與骨質(zhì)疏松性骨折密切相關(guān)。但目前關(guān)于鐵蓄積的動物實驗研究模型大多為大鼠，且由于大鼠骨皮質(zhì)內(nèi)缺乏哈佛氏系統(tǒng)，無哈佛氏重建，故大鼠模型不適合作為研究鐵蓄積狀態(tài)對骨質(zhì)疏松患者皮質(zhì)骨影響的動物模型[9]。此外，大鼠體積小，不易多次采集骨活檢標(biāo)本或大量血液標(biāo)本。鑒于鐵蓄積與絕經(jīng)后骨代謝異常，特別是與骨質(zhì)疏松的形成有關(guān)，而骨質(zhì)疏松最嚴(yán)重的并發(fā)癥是骨質(zhì)疏松性骨折，故鐵蓄積與骨質(zhì)疏松性骨折關(guān)系的研究中將家兔作為研究對象，可能有以下優(yōu)勢[10]：1)家兔性成熟后骺板閉合與人類相似，具有明顯的哈佛氏重建能力，有利于皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)的觀察；2)家兔骨骼轉(zhuǎn)化約為人的3倍，可在短期內(nèi)觀察骨折愈合時骨組織的變化；3)家兔耳緣靜脈采血和注射藥物方法簡便；4)家兔四肢骨屬于長骨，其結(jié)構(gòu)與人類相似度較高。因此，本研究參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[5, 11-14]，設(shè)計了新的鐵蓄積動物模型建立方案：給予去卵巢家兔耳緣靜脈注射大劑量蔗糖鐵注射液誘導(dǎo)鐵蓄積狀態(tài)骨質(zhì)疏松模型。

臨床反映鐵穩(wěn)態(tài)的指標(biāo)主要是血清鐵蛋白。每個血清鐵蛋白可結(jié)合4 500個鐵原子，能較好地反映鐵貯存能力[15]。臨床上蔗糖鐵注射液主要用于正在補充促紅細(xì)胞生成素的需長期血液透析病人的缺鐵性貧血治療，毒性極低，但用藥過量會導(dǎo)致急性鐵過載(鐵蓄積)。蔗糖鐵注射液成人的治療劑量為2-3 mg/kg，根據(jù)體表面積折算法[16]，算出兔的等效劑量約為6.17-9.25 mg/kg，為了達(dá)到鐵蓄積的目的，本研究鐵蓄積組采用15 mg/kg作為誘導(dǎo)劑量，并通過定期檢測血清P1NP、CTX、血清鐵蛋白水平及腰椎骨密度對動物模型進(jìn)行評估。目前研究認(rèn)為[17,18]，P1NP在血清中的含量可反映I 型膠原的合成速率和骨轉(zhuǎn)換情況，是監(jiān)測成骨細(xì)胞活力和新骨形成的特異性敏感骨代謝生化指標(biāo)；CTX則可反映破骨細(xì)胞骨吸收活性，是較理想的反映骨吸收速率的骨代謝生化指標(biāo)。因此，血清P1NP和CTX可分別特異性反映成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性[19, 20]。骨密度檢測是評估骨質(zhì)疏松模型建立的必備無創(chuàng)手段，但目前尚未見新西蘭兔正常骨密度值的報道，也無其骨質(zhì)疏松的診斷標(biāo)準(zhǔn)，故本研究結(jié)合相關(guān)動物骨質(zhì)疏松模型制作和評估的報道[21-23]，在參照《中國人骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)專家共識(第三稿·2014版)》[24]的基礎(chǔ)上，采用新西蘭兔骨量丟失百分率(%)來評估骨質(zhì)疏松模型：以正常對照組同期骨密度值作為正常值對鐵蓄積組進(jìn)行診斷，若骨密度丟失百分率超過正常值的25%，即可診斷為骨質(zhì)疏松，若同時伴有一處或多處骨折則為嚴(yán)重骨質(zhì)疏松。

造模結(jié)果顯示，經(jīng)蔗糖鐵誘導(dǎo)后，鐵蓄積組(第8周)較去勢組(第12周)更早出現(xiàn)鐵蓄積狀態(tài)，且血清鐵蛋白水平隨著造模時間的延長呈上升趨勢，至造模后24周仍較去勢組和對照組明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；鐵蓄積組血清P1NP，CTX水平在造模后20周及24周均明顯高于去勢組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；腰椎骨密度檢測方面，與同時期對照組比較，鐵蓄積組與去勢組的腰椎骨密度均在造模后第16周開始出現(xiàn)下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且在造模后24周達(dá)骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)(骨密度下降超過25%)；鐵蓄積組腰椎骨密度在造模后20周及24周均明顯低于去勢組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但造模后第20周鐵蓄積組腰椎骨密度丟失百分率未超過同期對照組骨密度的25%。本研究造模結(jié)果表明，去卵巢結(jié)合蔗糖鐵可成功誘導(dǎo)家兔鐵蓄積狀態(tài)骨質(zhì)疏松模型的建立；所有去卵巢家兔在造模過程中均出現(xiàn)血清P1NP，CTX水平增高的情況，這符合絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松骨轉(zhuǎn)換加快、骨丟失加速的病理學(xué)特征。其中，鐵蓄積家兔血清P1NP，CTX水平增高更為明顯，以上研究結(jié)果與張林林等[2]的研究結(jié)果相符。值得注意的是，通過定期測量動物腰椎骨密度后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過蔗糖鐵誘導(dǎo)的鐵蓄積去卵巢家兔(鐵蓄積組)的骨量丟失速度較單純?nèi)ヂ殉布彝?去勢組)明顯加快，且骨量丟失程度更為嚴(yán)重，但不能明顯縮短動物骨質(zhì)疏松模型造模時間，這可能與蔗糖鐵使用的劑量有關(guān)，后期筆者將進(jìn)一步探索蔗糖鐵在誘導(dǎo)家兔鐵蓄積狀態(tài)的最大適宜劑量，再通過加大蔗糖鐵誘導(dǎo)劑量，驗證其在縮短單純?nèi)ヂ殉卜ń⒐琴|(zhì)疏松模型造模時間的可行性。

綜上所述，蔗糖鐵經(jīng)家兔耳緣靜脈注射可成功誘導(dǎo)家兔鐵蓄積狀態(tài)，同時促進(jìn)去勢后家兔骨質(zhì)疏松的發(fā)展，蔗糖鐵結(jié)合去卵巢法是建立家兔鐵蓄積狀態(tài)骨質(zhì)疏松模型的可行方法，該模型能較好的模擬女性絕經(jīng)后鐵蓄積狀態(tài)，加上家兔作為研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的優(yōu)勢，是比較適合廣泛應(yīng)用的絕經(jīng)后鐵蓄積狀態(tài)骨質(zhì)疏松動物模型。