方幸 李世昌* 徐帥

1.華東師范大學(xué) 青少年健康評價與運動干預(yù)教育部重點實驗室，上海 200241 2.華東師范大學(xué) 體育與健康學(xué)院，上海 200241

骨折對于人體來說是最常見的大型器官損傷。骨折愈合是一個復(fù)雜的過程，涉及許多類型的細胞、信號分子和生長因子的相互作用。炎癥、修復(fù)和重塑是骨折愈合生理過程的三個階段[1]。關(guān)于骨折的修復(fù)階段，Einhorn等人[2]認為，骨修復(fù)是一種產(chǎn)后再生過程，其重現(xiàn)了許多胚胎期骨骼發(fā)育的生物事件。雖然大多數(shù)骨折都能愈合，但仍有10%-15%的骨折是延遲愈合或者不愈合。疾病(糖尿病、肥胖)、環(huán)境因素(吸煙)、以及一些遺傳因素不利于骨折愈合[3,4]。而非常重要的局部因素是骨折位點周圍的軟組織情況，因為骨折除了骨骼損傷之外，還涉及相鄰的肌肉、肌腱、血管、神經(jīng)及其他軟組織損傷。肌肉組織損傷嚴重程度與骨折不愈合的發(fā)生率高度相關(guān)，因此越來越多的研究者關(guān)注到肌肉組織對骨骼修復(fù)作用的重要性[5,6]，并且也將骨折看作是肌骨系統(tǒng)中最常見的損傷之一[7]。

肌肉和骨骼都來源于中胚層，又相互鄰近，在遺傳學(xué)、生理學(xué)、解剖學(xué)上這兩種組織之間存在不可分割的密切關(guān)系。過去常常將肌肉對骨骼的作用歸因于機械作用，但最新研究發(fā)現(xiàn)肌肉和骨骼在生物合成和代謝上存在共存和適應(yīng)關(guān)系[8]。大量臨床數(shù)據(jù)表明肌肉質(zhì)量的增加和骨密度的增加，與骨折風險的降低緊密相關(guān)[9]；肌肉萎縮和骨質(zhì)疏松可能是由共同的代謝信號導(dǎo)致[10]；中醫(yī)學(xué)提出“骨肉不相親”與骨質(zhì)疏松癥有密切聯(lián)系[11]。Pederse[12]、Kaji[13]和Hamrick[14]都發(fā)現(xiàn)肌肉組織作為內(nèi)分泌器官分泌的肌肉因子(myokines)能夠調(diào)節(jié)骨骼生長。此外，以黃宏興為組長的專家們經(jīng)過多次會議討論后達成共識認為肌肉組織是調(diào)節(jié)骨骼潛在細胞與信號的重要來源，且肌肉組織的微環(huán)境對骨骼發(fā)育、修復(fù)和重塑會產(chǎn)生重要影響[15]。Davis等人[16]就以肌肉-骨骼之間的關(guān)系為研究方向證明了肌肉組織本身對于骨形成和骨修復(fù)具有積極作用，其中myokines對于骨折愈合具有重要意義。

1 肌肉是干細胞的重要來源

骨折治療對于骨修復(fù)階段的目標是確保骨折穩(wěn)定性、骨折位點處的再血管化，并提供刺激使得損傷部位的骨祖細胞/骨骼干細胞(osteoprogenitors/Bone stem cells)能夠分化形成成熟的成骨細胞，從而促進骨折修復(fù)。當骨骼干細胞被損壞或者缺乏，對骨修復(fù)的結(jié)果具有不利的影響。Shah等人[6]認為骨修復(fù)過程中的主要事件是骨折位點的骨祖細胞/骨骼干細胞募集、增殖、擴張和積聚，而骨骼干細胞來源豐富是骨再生必要的因素之一。

組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，骨膜內(nèi)的細胞會迅速對骨折信號作出反應(yīng)，因為在損傷后24-48小時內(nèi)可以檢測到骨膜反應(yīng)[17]。這種骨膜反應(yīng)強烈會導(dǎo)致大的骨痂形成并且通過軟骨內(nèi)成骨來促進骨折愈合。目前的治療范例都將骨膜中的干細胞活化、擴增和分化作為新血管形成、骨形成和骨重塑的必要環(huán)節(jié)。毋庸置疑，骨膜是骨骼干細胞的有效來源，在骨修復(fù)中扮演著極其重要的角色。但是除了骨膜外，還有其他潛在來源可能參與骨修復(fù)[6,18](圖1)，包括骨髓干細胞(bone marrow stem cells, BMSCs)、循環(huán)來源的干細胞(systemic circulation-derived stem Cells, SCDSCs)、血管內(nèi)皮衍生的周細胞(vascular endothelium-derived pericytes, VEDPs)和肌肉來源干細胞(muscle-derived stem cells, MDSCs)。

圖1 骨祖細胞/骨骼干細胞的潛在來源[17]Fig.1 The potential source of osteoprogenitors/bone stem cells

經(jīng)研究表明，BMSCs在外部骨痂組織的形成中作用較??；SCDSCs能夠被招募到骨折位點，但是細胞數(shù)量又相對較少，并且SCDSCs不是直接通過細胞對骨修復(fù)產(chǎn)生作用，而是通過旁分泌因子影響骨修復(fù)；VEDPs主要參與到骨重塑過程中發(fā)生的骨形成，而不是骨修復(fù)過程中的骨形成。 MDSCs雖然目前研究較少，但是已經(jīng)成為近年來的研究熱點[19]。

無論是身體創(chuàng)傷所致的結(jié)果(骨化性肌炎)，還是遺傳疾病(進行性骨化性纖維發(fā)育不全)所致，肌肉是異位骨形成最常見的位點之一。此外，在頑固性骨折愈合或牽張成骨的情況下，通常在肌肉附近可看到骨的形成。許多檢查骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)成骨潛力的研究結(jié)果已經(jīng)報道了其在肌肉組織存在情況下的作用[20]。Jackson等人[21]對在戰(zhàn)爭中經(jīng)歷過爆炸創(chuàng)傷的病人進行肌肉活檢，發(fā)現(xiàn)他們的BMP-1 mRNA和蛋白水平很高。爆炸創(chuàng)傷伴隨異位骨化的發(fā)生率很高，因此這似乎意味著BMPs與肌原細胞分化成成骨細胞有著密切的關(guān)系。而在細胞體外培養(yǎng)中也證明了這個猜想，克隆的成肌細胞系和原代肌細胞容易在BMPs存在的情況下下調(diào)肌肉基因的表達，上調(diào)骨性標志物的表達[5]。與此相一致的是，在BMPs存在下，肌細胞能夠分化成表達骨性標志物的細胞[22]，衛(wèi)星細胞衍生的成肌細胞在BMPs給藥的情況下可以分化成成骨細胞。Hashimoto 等人[23]已觀察到衛(wèi)星細胞表達成肌細胞標志物(Pax7, MyoD)和成骨細胞標志物(ALP, Runx2)，并且能夠自發(fā)地分化成成骨細胞。眾多研究認為，肌源細胞對BMPs的成骨反應(yīng)比其他類型細胞更好。在骨折愈合方面很多新興的方法是利用BMP-2修飾肌細胞從而促進其分泌BMP-2[16]。這些方法中經(jīng)常利用離體基因治療法迫使培養(yǎng)的成肌細胞表達BMPs，再將它們植入實驗動物后可以導(dǎo)致新骨形成。

在骨折模型中，Kaufman等人[24]通過使用硝酸纖維素膜(此膜僅能使3.5kDa到50kDa孔徑范圍內(nèi)的分子從肌肉穿過到達骨骼，而阻止細胞通過)將肌肉層和骨折位點分離，最終阻止了骨修復(fù)。類似的，Harry等人[25]利用聚合物將脛骨骨折模型的肌肉層和骨折位點阻隔，結(jié)果明顯破壞骨折的愈合效果。但是在此模型中發(fā)現(xiàn)骨折位點再血管化數(shù)量多，并且該物理膜能夠?qū)ιL因子和細胞因子滲透。因此，對于肌肉阻隔導(dǎo)致骨修復(fù)破壞的可能解釋是MDSCs的缺乏。在大量臨床骨科治療中發(fā)現(xiàn)嚴重損傷的骨折會損壞骨膜的完整性，或者因手術(shù)后管理會耗盡骨膜中關(guān)鍵骨骼干細胞的情況，但是骨修復(fù)仍然可以發(fā)生，該情況隱含的反映了骨骼干細胞有補償性的第二種系統(tǒng)的存在。而Liu等人[5]表明該系統(tǒng)是與骨骼緊密相關(guān)的肌肉組織，并且提出肌肉是骨修復(fù)的“次要骨膜(secondary periosteum)”，從而表明骨骼干細胞的潛在重要替代來源是肌肉組織。

2 肌肉組織是骨修復(fù)的重要元件

肌源性干細胞在骨修復(fù)過程中為募集骨骼干細胞提供了很大貢獻，但是肌肉組織自身對于骨修復(fù)也是極其重要的。早期致力于大鼠骨折模型研究的Utvag團隊，從1998年以來就得到了很多有價值的結(jié)論：1)骨膜和肌肉完好的連接對骨折愈合很重要[26]；2)骨折發(fā)生后早期肌肉-骨膜界面的完整性是骨膜骨痂形成的重要前提條件[27]；3)肌肉覆蓋不良可延緩大鼠的骨折愈合，較大范圍的肌肉組織缺損可能對早期骨折愈合有負面影響[28]；4)切除大肌肉片段明顯損害脛骨骨折愈合[29]。一些臨床研究表明肌肉對于骨折愈合的效果優(yōu)于皮膚組織，并把這歸因于肌肉組織中血管比皮膚組織高。Harry等人[30]將小鼠脛骨骨折模型分成兩個試驗組，比較肌肉組織和皮膚組織覆蓋在骨折位點上的愈合效果，以及在愈合過程中的血管密度。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在骨折愈合所有時間點中，雖然皮膚組織具有較高的血管密度，但是肌肉組織卻能夠加速骨折愈合。該實驗恰好證明了肌肉組織促進骨折愈合的最重要原因并不是血管密度高，而可能是上述提到的MDSCs的作用。

另外，Hao等人[31]利用大鼠股骨骨折模型將股四頭肌通過肉毒桿菌毒素A毒素使其暫時性的萎縮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨折愈合效果不理想。Aboukhalil等人[32]也發(fā)現(xiàn)小鼠肌肉衰減退化或營養(yǎng)不良并伴有慢性炎癥會延遲骨再生，繼而造成骨折風險升高。骨折愈合的復(fù)雜程度與周圍肌肉組織創(chuàng)傷的嚴重程度有關(guān)，而創(chuàng)傷引發(fā)的炎癥情況是肌肉骨骼健康和再生的主要決定因素，所以骨折延遲愈合和不愈合的發(fā)生，將部分原因歸因于肌肉創(chuàng)傷誘發(fā)的局部炎癥反應(yīng)是合理的[33]。最近，Pollot等人[34]也表明肌肉損失會影響鄰近骨的骨折愈合效果。綜上所述，完整無損的肌肉組織是骨修復(fù)的重要元件，甚至在骨折愈合中扮演著不可或缺以及不可替代的角色[35]。

3 肌肉因子對骨修復(fù)的作用

肌肉與骨骼關(guān)系密切，很多研究者將肌肉和骨骼視為一個“單元(unit)”或“系統(tǒng)(system)”。肌肉不僅包含高度骨誘導(dǎo)型細胞群體[36]，還能夠分泌細胞因子及生長因子，從而對骨骼生長進行調(diào)節(jié)。Pedersen等人[12,37]研究認為骨骼肌為內(nèi)分泌器官，并將其分泌的肌源性因子定義為myokines；肌肉分泌的myokines包括胰島素樣生長因子1(Insulin-like growth factor-1, IGF-1)、成纖維細胞生長因子 2(Fibroblast growth factor-2, FGF-2)、肌肉生長抑制素(Myostatin)、白介素6(Interleukin-6, IL-6)、骨甘氨酸(Osteoglycin，OGN)、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase-2, MMP-2)、鳶尾素(Irisin)以及富含半胱氨酸的酸性蛋白(Secreted Protein, Acidic and Rich in Cysteine, SPARC)等其他分泌因子，共同調(diào)節(jié)骨代謝[13](圖2)。Myokines能夠穿過骨膜淺表的纖維層到達骨膜深面的生發(fā)層，作為存在于骨膜生發(fā)層中成骨細胞的信號分子，調(diào)節(jié)骨形成。肌肉和骨骼之間存在的生化“串擾(crosstalk)”已經(jīng)成為研究熱點，而深入了解肌肉和骨骼之間的相互作用關(guān)系，對于發(fā)展有效的骨修復(fù)新戰(zhàn)略至關(guān)重要[38]。

圖2 肌肉因子對骨形成的作用[13]Fig.2 The effects of myokines on bone formation

IGF-1和FGF-2作為兩個重要的生骨因子[14]，由肌管分泌且在肌肉組織中含量豐富。Hamrick等人[39]運用免疫組織化學(xué)技術(shù)和 ELISA 技術(shù)發(fā)現(xiàn)在骨骼肌肉交界面上，肌纖維直接附著在骨膜表面；IGF-1和 FGF-2在交界面上可被檢測到，同時IGF-1受體和FGF-2受體在骨膜上也被檢測到。小鼠肌肉中過表達IGF-1會導(dǎo)致肌肉質(zhì)量增加和皮質(zhì)骨骨量增加；而與正常小鼠相比，IGF-1只在肝細胞中表達的基因敲除小鼠表現(xiàn)出骨小梁減少[40]。早期研究已證實，通過全身或局部給予FGF-2可增加生長發(fā)育中的大鼠骨膜內(nèi)骨形成，而FGF-2通過經(jīng)典的胞吐作用從細胞內(nèi)輸出，因此在體內(nèi)和體外通過機械誘導(dǎo)肌肉細胞膜破裂，使得FGF-2釋放是其中的一種機制[14]。

Myostatin主要由肌肉組織分泌，對肌肉的生長具有負調(diào)節(jié)作用。Elkasrawy等人在體外研究中發(fā)現(xiàn)，Myostain抑制BMSCs的增殖和軟骨細胞的分化，并且發(fā)現(xiàn)肢體創(chuàng)傷導(dǎo)致肌纖維損傷使得Myostatin表達增加[41]。局部使用外源性的Myostatin會加劇肌肉纖維化，而抑制骨骼修復(fù)[42]。

體外實驗發(fā)現(xiàn)受到機械刺激后肌管會通過釋放IL-6促進破骨細胞形成、刺激骨吸收作用[43]，這可能會有利于骨折愈合最后階段的骨重塑。OGN由成肌細胞產(chǎn)生，能夠提高成骨細胞骨形成相關(guān)參數(shù)的表達[44]。FAM5C在肌管中過表達會使得Osterix、ALP和OCN mRNA水平增加，而抑制FAM5C的表達會阻止骨形成標志物的產(chǎn)生[45]。與SPARC 相似， MMP-2存在于肌肉和骨骼中，對肌骨修復(fù)起重要作用[46]。Irisin是新發(fā)現(xiàn)的運動介導(dǎo)調(diào)控能量代謝的肌肉因子，其表達水平下降與骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生具有相關(guān)性[47]。

其他能夠作用于骨骼的候選myokines還有白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、肌肉素(Musclin)等[13]。目前，關(guān)于肌肉作為分泌器官對骨骼作用的研究越來越多，尋找myokines并了解其生理生化作用是一個有趣的研究方向。因此，進一步探討關(guān)于myokines對骨代謝作用的更多內(nèi)容可能為骨修復(fù)研究領(lǐng)域提供新的視角。

4 結(jié)論

骨折愈合取決于高度協(xié)調(diào)的一系列組織、細胞和分子事件。肌肉是骨骼的“鄰居”，雖然兩者作為運動系統(tǒng)在機械力學(xué)上關(guān)系緊密，但是在生理生化上的聯(lián)系同樣也很密切。肌肉無論是作為骨骼干細胞來源、作為內(nèi)分泌器官還是其組織本身來說對于骨修復(fù)發(fā)揮著獨特的作用。在軍事創(chuàng)傷中，經(jīng)常遇到鄰近骨折的肌肉組織體積的損失并且骨膜也受到粉碎性的損壞，以至于可能導(dǎo)致終身殘疾。然而肌肉組織包含高度骨誘導(dǎo)型細胞群體，加上成肌細胞容易被遺傳修飾，所以若能夠通過基因治療和組織工程對這類相鄰骨膜及肌肉都被破壞的機械性骨折進行治療，那么這可能會幫助患者骨折愈合避免殘疾。因此，了解肌肉在組織、細胞及分子水平上對于骨形成和修復(fù)中的作用，將為指導(dǎo)外科手術(shù)治療嚴重的骨骼損傷提供新的研究領(lǐng)域。