魏江存 陳 勇 謝 臻 李耀華 庾延和 闕祖亮 張 昕 龐丹清 鄧麗紅

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530020

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瑤藥扁擔(dān)藤薄層鑒別和原兒茶酸提取工藝及含量測(cè)定研究

魏江存 陳 勇*謝 臻 李耀華 庾延和 闕祖亮 張 昕 龐丹清 鄧麗紅

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530020

目的：以原兒茶酸為指標(biāo)性成分，建立扁擔(dān)藤薄層鑒別和提取工藝以及其含量測(cè)定方法。方法：薄層鑒別采用硅膠GF254薄層板，以體積比甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(12∶6∶1)為展開劑，置紫外燈(254nm)下檢視。采用正交試驗(yàn)，以原兒茶酸含量為指標(biāo)，考察溶劑濃度、溶劑體積和回流時(shí)間對(duì)扁擔(dān)藤中原兒茶酸提取工藝的影響；采用色譜柱BDS HYPERSIL C18柱(4.60mm×250mm, 5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸(28∶72)，檢測(cè)波長(zhǎng)258nm，流速1.0mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL。結(jié)果：薄層色譜中可以檢出原兒茶酸，斑點(diǎn)清晰，專屬性好。原兒茶酸進(jìn)樣量在0.0292～0.1460 μg(R2=0.9991)范圍呈良好的線性關(guān)系。扁擔(dān)藤低、中、高加樣組原兒茶酸的平均回收率分別為99.32%(RSD=1.73%)、98.54%(RSD=0.96%)和97.83%(RSD=1.40%)。溶劑濃度為影響扁擔(dān)藤中原兒茶酸提取效果的主要因素，確定最佳工藝條件為40%乙醇，溶劑體積為20mL，提取時(shí)間2.5h。結(jié)論：優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定，提取率高。該方法能有效鑒別瑤藥扁擔(dān)藤，能準(zhǔn)確地測(cè)定其原兒茶酸的含量，為開發(fā)利用其藥材資源提供科學(xué)依據(jù)。

扁擔(dān)藤；原兒茶酸；含量測(cè)定；薄層鑒別；提取工藝;HPLC

扁擔(dān)藤Tetrastigmaplanicaule(Hook.) Gagnep.系葡萄科崖爬藤屬植物，又名扁骨風(fēng)、過(guò)江扁龍、扁藤、腰帶藤、大蘆藤、鐵帶藤和羊帶風(fēng)等，分布于我國(guó)廣西、貴州、云南、福建、廣東和西藏東南部等地區(qū)，生于山谷林中或山坡石縫中，海拔100～2100m[1]。扁擔(dān)藤是我國(guó)瑤族的常用藥材，其性平，味微澀，入風(fēng)、火、土、水塔，藤莖及根均可入藥，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、除風(fēng)解毒和消腫止痛的功效，臨床用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、跌打損傷、風(fēng)濕痹痛、腰腿痛、下肢潰瘍、半身不遂、蕁麻疹和咳嗽哮喘等病癥[2-3]。

近年來(lái)瑤藥扁擔(dān)藤的藥用價(jià)值越來(lái)越受到重視，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，扁擔(dān)藤主要含有黃酮類、酚酸類、萜類、皂苷類、甾體、糖類和鞣質(zhì)等化合物[4-5]，酚酸類包括原兒茶酸、水楊酸、香草酸和丁香酸等成分[6]。原兒茶酸(protocatechuic acid)有廣泛的藥理作用和生物活性，目前對(duì)原兒茶酸資源的開發(fā)已應(yīng)用到醫(yī)藥、食品和保健品等方面。原兒茶酸具有抗菌[7]、抗病毒[8-9]、抗心血管系統(tǒng)疾病[10-12]和祛痰平喘[13]等藥理作用，臨床主要用于治療慢性氣管炎[13]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)扁擔(dān)藤進(jìn)行薄層鑒別和含量測(cè)定的相關(guān)研究較少，為保證其藥材質(zhì)量及臨床療效，筆者實(shí)驗(yàn)建立了扁擔(dān)藤中原兒茶酸的薄層鑒別和含量測(cè)定方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 2695型高效液相色譜儀(包括2489UV，四元泵、真空脫氣泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和Empower3液相工作站，美國(guó)Waters公司)；Practum224-1CN分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；Simplicity超純水系統(tǒng)(密理博中國(guó)有限公司)；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HWS-26電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；DHG - 9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；尼龍66(Nylon)-22μm 微孔濾膜(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 材料 原兒茶酸對(duì)照品(批號(hào)：110809-201604，中國(guó)藥品生物制品有限公司)；扁擔(dān)藤藥材采于廣西賀州市富川縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室廖月葵高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為葡萄科(Vitaceae)崖爬藤屬(Tetrastigma)大型木質(zhì)藤本植物扁擔(dān)藤Tetrastigmaplanicaule(Hook.)Gagnep。薄層硅膠GF254(青島海洋化工廠)，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 扁擔(dān)藤樣品制備 采集扁擔(dān)藤藥材，自然曬干后，將其粉碎，以備樣品含量測(cè)定使用。

2.2 薄層鑒別 稱取扁擔(dān)藤藥材粗粉3.0g，加40%乙醇60mL，回流2.5h，濾過(guò)，濾液揮干至約3 mL作為扁擔(dān)藤供試品溶液。取原兒茶酸對(duì)照品適量，加甲醇使溶解，配制成濃度為292μg/mL原兒茶酸對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以體積比甲苯-乙酸乙酯-甲酸(12∶6∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(254nm)下檢視，扁擔(dān)藤供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 波長(zhǎng)的確定 用甲醇溶解并稀釋原兒茶酸對(duì)照品溶液，以甲醇為參比液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，分析結(jié)果，確定原兒茶酸的最佳吸收波長(zhǎng)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，原兒茶酸在波峰位子1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)都有最大吸收，故根據(jù)原兒茶酸的吸收曲線及最佳的3個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)(分別是258、294、371nm)，確定最佳吸收波長(zhǎng)為258nm。

2.3.2 色譜條件 色譜柱BDS HYPERSIL C18柱(4.60mm×250mm, 5μm)，流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸(28∶72)，檢測(cè)波長(zhǎng)258nm，流速1.0mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL，按照上述條件各組分分離度良好。結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取原兒茶酸對(duì)照品14.6mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得原兒茶酸對(duì)照品溶液(292μg/mL)；精密量取上述原兒茶酸對(duì)照品溶液1mL，置50mL量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，制成原兒茶酸對(duì)照品溶液(5.84μg/mL)。

2.3.4 供試品溶液制備 精密稱定扁擔(dān)藤藥材粗粉1.0g，置具塞錐形瓶中回流提取，以半徑0.65cm，13000r/min離心10min，取上清液，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取原兒茶酸對(duì)照品溶液(濃度為5.84μg/mL)5、8、12、16、20、25μL注入液相色譜儀，以峰而積和進(jìn)樣量(μg)分別為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。原兒茶酸Y=3.0×106X-19945(R2=0.9991)。結(jié)果，原兒茶酸進(jìn)樣量在0.0292～0.1460μg范圍呈良好的線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密取原兒茶酸對(duì)照品溶液適量(5.84ug/mL)，按2.3.2項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算原兒茶酸峰面積的RSD為0.61%，小于3%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批扁擔(dān)藤藥材粗粉1.0g，精密稱定，按2.3.4項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，分別在供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h按2.3.2項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算扁擔(dān)藤中原兒茶酸峰面積的RSD為2.92%，小于3%，說(shuō)明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批扁擔(dān)藤藥材粗粉1.0g，共6份，按2.3.4項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，按2.3.2項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算扁擔(dān)藤中原兒茶酸平均含量為0.1458mg/g，其RSD為0.85%，小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批已知含量的扁擔(dān)藤藥材粗粉0.5g(0.1458mg/g)，共9份，分成3組，即低、中、高加樣組(0.5g藥材含量的80%、100%和120%加樣，加樣量分別為0.0583mg、0.0729mg、0.0875mg)，扁擔(dān)藤低、中、高加樣組的原兒茶酸的平均回收率分別為99.32%、98.54%、97.83%，RSD分別為1.73%、0.96%、1.40%(n=3)，表明該方法準(zhǔn)確性良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 扁擔(dān)藤中原兒茶酸的加樣回收率實(shí)驗(yàn)

3 提取工藝

3.1 單因素考察

3.1.1 提取方法考察 以原兒茶酸提取時(shí)間1h、20 mL 25%乙醇為提取條件，分別采用回流提取法、超聲提取法和溶劑浸漬法對(duì)扁擔(dān)藤藥材進(jìn)行原兒茶酸提取，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，回流提取法對(duì)原兒茶酸提取率高，故本實(shí)驗(yàn)選用回流提取法。結(jié)果見(jiàn)圖4。

3.1.2 溶劑濃度考察 固定原兒茶酸提取時(shí)間1h、20mL溶劑，采用回流提取法，以乙醇和甲醇不同濃度對(duì)扁擔(dān)藤中原兒茶酸得率做單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)乙醇和甲醇濃度都為10%、25%、40%、60%和85%，結(jié)果顯示40%乙醇回流提取率較高。結(jié)果見(jiàn)圖5。

3.1.3 提取體積考察 以原兒茶酸提取時(shí)間1h和40%乙醇，采用回流提取法，以溶劑提取體積對(duì)扁擔(dān)藤中原兒茶酸得率做單因素試驗(yàn)，提取體積為15、20、25、30mL，結(jié)果顯示體積為25mL時(shí)的提取率最高。結(jié)果見(jiàn)圖6。

3.1.4 提取時(shí)間考察 以40%乙醇25mL，采用回流提取法，以提取時(shí)間對(duì)扁擔(dān)藤中原兒茶酸的得率做單因素試驗(yàn)，設(shè)提取時(shí)間為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，結(jié)果顯示，扁擔(dān)藤提取時(shí)間在2.5h和3.0h時(shí)原兒茶酸得率較高，而這兩個(gè)提取時(shí)間對(duì)原兒茶酸得率基本沒(méi)有顯著差別，考慮到能耗，所以選擇提取時(shí)間為2.5h。結(jié)果見(jiàn)圖7。

3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 單因素考察分析實(shí)驗(yàn)表明，本實(shí)驗(yàn)最終采取不同乙醇濃度為溶劑的提取方法，考察了溶劑濃度(10%、25%、40%乙醇)、溶劑體積(20、30、40mL)、提取時(shí)間(1.5、2.0、2.5h)三個(gè)條件。根據(jù)正交設(shè)計(jì)軟件，選用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平

3.3 正交實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析

取扁擔(dān)藤藥材粗粉1.0g，精密稱定，按照上述扁擔(dān)藤中原兒茶酸的提取方法進(jìn)行提取，再依供試品溶液的制備方法操作，按L9(34)正交設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，使用高效液相色譜法對(duì)扁擔(dān)藤中原兒茶酸成分進(jìn)行含量測(cè)定。見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

3.4 方差分析結(jié)果 由表3、4可知，以扁擔(dān)藤中原兒茶酸的含量為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，由于多種因素會(huì)影響對(duì)扁擔(dān)藤中原兒茶酸成分的提取。在考察范圍內(nèi)，就原兒茶酸提取率而言，乙醇濃度對(duì)扁擔(dān)藤中原兒茶酸的提取率有顯著性影響；根據(jù)正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果確定最佳工藝條件為A3B1C3，即乙醇濃度是40%，提取溶劑體積20ml，回流提取時(shí)間是2.5h，且各影響因素的強(qiáng)弱為乙醇濃度>提取時(shí)間>溶劑體積，所以對(duì)扁擔(dān)藤中原兒茶酸的提取率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素是乙醇濃度。

表4 方差分析結(jié)果

注：F0.01(2,2)=99.00，F(xiàn)0.05(2,2)=19.00；

Note：F0.01(2,2)=99.00，F(xiàn)0.05(2,2)=19.00。

4 樣品含量測(cè)定

在最佳提取工藝條件下，分別按2.3.4項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液，平行稱取扁擔(dān)藤藥材粗粉3份，每份1.0g，按2.3.2項(xiàng)下條件測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算原兒茶酸的提取率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為原兒茶酸的平均提取率為2.83%，RSD=2.71%(n=3)，說(shuō)明優(yōu)選的工藝可行，重現(xiàn)性較好。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品測(cè)定結(jié)果

5 討論

5.1 薄層色譜條件的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)中分別考察了三氯甲烷-甲醇-甲酸、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸、甲苯-乙酸乙酯-甲酸、三氯甲烷-正丁醇-冰醋酸和三氯甲烷-丙酮-甲酸等展開系統(tǒng)，結(jié)果顯示，甲苯-乙酸乙酯-甲酸(12∶6∶1)作為展開劑時(shí)，斑點(diǎn)相對(duì)清晰，分離度較好。

5.2 流動(dòng)相的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)中考察了不同甲醇-酸水系統(tǒng)、乙腈-酸水系統(tǒng)以及甲醇-水和乙腈-水系統(tǒng)(0.1%、0.2%磷酸，0.1%、0.2%冰醋酸，純水)，結(jié)果表明，甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，分離度相對(duì)較好，基線較平穩(wěn)，故流動(dòng)相確定為甲醇-0.1%磷酸水溶液。

5.3 波長(zhǎng)的選擇 采用二極管陣列檢測(cè)器，在200～400nm波長(zhǎng)下對(duì)原兒茶酸對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，原兒茶酸在波長(zhǎng)258、294、371nm下有最大吸收。在294、371nm檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，其基線相對(duì)漂移以及雜峰比較多，而在258nm時(shí)，基線相對(duì)平穩(wěn)，雜峰較少，溶劑峰小，原兒茶酸響應(yīng)值較大，故最終選用258nm作為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

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國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260673、81360524)；廣西中醫(yī)藥大學(xué)科研創(chuàng)新項(xiàng)目(No.YJS201625);壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心(No.桂教科研[2013]20號(hào))；廣西中醫(yī)藥管理局2013年中醫(yī)藥民族醫(yī)藥繼承創(chuàng)新工程立項(xiàng)課題(GZZY13-13)；廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(桂科基字[2014]32號(hào))；廣西重點(diǎn)學(xué)科壯藥學(xué)(桂教科研[2013]16號(hào))；廣西八桂學(xué)者中藥創(chuàng)新理論與藥效研究(J13162)。

魏江存(1989-)，男，漢族，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬镔|(zhì)量控制。E-mail: WJC2553@163.com

陳勇(1961-)，男，漢族，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幖捌渲苿┵|(zhì)量分析。E-mail: cy6381@163.com

R284.2

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1007-8517(2017)14-0030-05

2017-05-11 編輯：程鵬飛)