程新宇，周成美，趙天翔，孫 虓，欒 嵐，吳 非，王翠芳

濾過膜與擦鏡紙雙層包埋法在細(xì)胞塊制作中應(yīng)用

程新宇1，周成美2，趙天翔3，孫 虓1，欒 嵐1，吳 非1，王翠芳1

濾過膜；雙層包埋；細(xì)胞塊

隨著分子生物學(xué)飛速發(fā)展，靶向治療在腫瘤治療中被廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)脫落細(xì)胞學(xué)制作方法，不能滿足臨床需求。如何在量少的標(biāo)本中盡可能大量收集細(xì)胞，減少細(xì)胞丟失在細(xì)胞塊制作中顯得尤為重要。本科室在實(shí)踐工作中將膜式液基薄層制作過濾器上的濾過膜(簡(jiǎn)稱濾過膜)用刀裁剪，放在包埋時(shí)裁好的擦鏡紙上，對(duì)收集的細(xì)胞沉淀物進(jìn)行雙層包埋，形成細(xì)胞塊。該方法操作簡(jiǎn)便，最大限度收集細(xì)胞，有利于惡性腫瘤類型的鑒別及靶向治療的開展，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本與材料 收集沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科2013～2016年各臨床科室送檢的脫落細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，包括胸水、腹水、心包積液及各種沖洗液。

1.1.2試劑與儀器 單克隆抗體一抗(即用型)CK7購自福州邁新公司，所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定。濾過膜，中佳SC-3612低速離心機(jī)，Leica-Asp300s全自動(dòng)脫水機(jī)，Leica-HM315R石蠟切片機(jī)，Leica-G-1140(C)石蠟包埋機(jī)，VENTANA-BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化儀。

1.2方法

1.2.1傳統(tǒng)方法離心 將送檢標(biāo)本室溫靜置15 min，取底部液體200 mL，分別裝入50 mL塑料尖底離心管4瓶，以800g離心10 min，棄去上清液，留下細(xì)胞沉淀物。在其中1瓶50 mL塑料尖底離心管底部取2滴細(xì)胞沉淀物，制備2張細(xì)胞傳統(tǒng)涂片，HE染色。

1.2.2乙醇固定單層包埋法 (1)傳統(tǒng)方法得到的細(xì)胞沉淀物，用95%乙醇10 mL固定6 h，入離心機(jī)800g離心10 min，吸去上清，留下細(xì)胞沉淀物；(2)用吸管挑出細(xì)胞沉淀物，放入裁好擦鏡紙上，將擦鏡紙對(duì)折包裹，入包埋盒；(3)按常規(guī)組織塊處理，固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色及免疫組化SP法染色

1.2.3濾過膜雙層包埋法 (1)傳統(tǒng)方法得到的細(xì)胞沉淀物，經(jīng)10%中性福爾馬林3 mL固定1 h，入離心機(jī)800g離心10 min，吸去上清，留下細(xì)胞沉淀物；(2)用刀將濾過膜裁下，對(duì)折壓緊后再對(duì)折壓緊，形成一個(gè)敞口錐形，放在包埋盒的擦鏡紙上(圖1)；(3)將準(zhǔn)備好的細(xì)胞沉淀物用吸管挑出，放在敞口錐形濾過膜錐底，再用裁好擦鏡紙包裹，放入包埋盒中(圖2)；(4)按常規(guī)組織塊處理，固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色及免疫組化SP法染色。

2 結(jié)果

乙醇固定單層包埋法，細(xì)胞分散，背景干凈(圖3)；濾過膜雙層包埋法，細(xì)胞量較多，細(xì)胞聚集，免疫組化SP法染色顯示CK7陽性結(jié)果定位準(zhǔn)確，背景清晰，易于診斷(圖4)。

①②③④

圖1濾過膜雙層包埋法制作流程圖2細(xì)胞沉淀物用吸管挑出，放在敞口錐形濾過膜錐底，再用裁好擦鏡紙包裹圖3乙醇固定單層包埋法(胸水)，細(xì)胞分散，惡性圖4濾過膜雙層包埋法(胸水)，細(xì)胞量較多，CK7呈陽性，惡性，SP法

3 討論

隨著分子生物學(xué)飛速發(fā)展，臨床個(gè)體化治療備受患者重視。傳統(tǒng)涂片制作方法的癌細(xì)胞檢出率低，重復(fù)性差，不能滿足臨床需求。近年脫落細(xì)胞學(xué)細(xì)胞塊制作備受推崇，有報(bào)道采用2%～4%瓊脂糖凝膠、石蠟雙重包埋法[1]等制作，終因制作方法復(fù)雜難以推廣。如何能最大限度保留細(xì)胞，并使散在分布細(xì)胞聚集成團(tuán)，防止細(xì)胞沉淀物丟失且操作簡(jiǎn)便的制作方法，是病理技術(shù)人員探索細(xì)胞塊制作的關(guān)鍵[2]。

濾過膜原本是膜式液基薄層制作中過濾器的一部分，過濾器直徑2 cm藍(lán)色管狀，一端敞口，一端有濾過膜，膜的過濾孔徑0.5 μm，功能是過濾器一端敞口套在機(jī)器負(fù)壓口吸引帶有保存液的液體標(biāo)本，液體標(biāo)本通過濾過孔徑0.5 μm濾過膜時(shí)，將液體標(biāo)本中細(xì)胞，收集在濾過膜內(nèi)、外兩側(cè)，解除負(fù)壓后制成液基薄片。

本實(shí)驗(yàn)組將過濾器上有濾過功能、濾過孔徑0.5 μm濾過膜，沿直徑2 cm藍(lán)色管口裁剪下來，形成直徑為2 cm的濾過膜，對(duì)折壓緊后再對(duì)折壓緊，形成敞口錐形，放在包埋的擦鏡紙上，離心后得到的細(xì)胞沉淀物入敞口錐形濾過膜錐形底，進(jìn)行雙層包埋。該方法是病理技術(shù)上的創(chuàng)新，國內(nèi)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

在制作細(xì)胞塊實(shí)驗(yàn)過程中，推薦使用乙醇固定單層包埋法。但此方法也有不足之處——細(xì)胞沉淀物經(jīng)乙醇固定，再用裁好擦鏡紙對(duì)折包好，入包埋盒，經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟，包埋時(shí)易與薄薄的擦鏡紙粘在一起，需有經(jīng)驗(yàn)技術(shù)人員細(xì)心打開，耗費(fèi)一定時(shí)間。若擦鏡紙質(zhì)量差，擦鏡紙打開過程中碎裂，導(dǎo)致細(xì)胞塊制作失敗。另外，細(xì)胞沉淀物大多呈灰白色，與擦鏡紙顏色基本一致，分辨有一定難度，通常會(huì)丟失一部分細(xì)胞。因此，我們尋找既能與細(xì)胞沉淀物一同固定脫水浸蠟，又能使包埋方法簡(jiǎn)便，還能防止細(xì)胞沉淀物不丟失的新材料。濾過膜高溫塑料材質(zhì)，過濾孔徑0.5 μm能使液體通過，并能與細(xì)胞沉淀物一起固定脫水透明浸蠟，形成蠟塊。濾過膜有韌性，對(duì)折壓緊再對(duì)折壓緊后，在包埋的擦鏡紙上，會(huì)形成敞口錐形，細(xì)胞沉淀物放入敞口錐形濾過膜錐形底，起到網(wǎng)住細(xì)胞沉淀物作用，防止細(xì)胞沉淀物丟失。內(nèi)層敞口錐形濾過膜是細(xì)胞沉淀物的第一道防線，外層包埋的擦鏡紙遇水緊緊粘在一起，是細(xì)胞沉淀物的第二道防線。包埋時(shí)病理技術(shù)人員直接用鑷子撕開擦鏡紙，露出濾過膜，灰白色細(xì)胞沉淀物在敞口錐形濾過膜錐形底中，使細(xì)胞沉淀物易于尋找收集。該方法簡(jiǎn)便且包埋節(jié)省時(shí)間，脫落細(xì)胞沉淀物得到最大限度收集，易于操作和推廣。

日常工作中將該方法用在膜式液基薄層制作后，臨床再次要求細(xì)胞塊制作收到良好效果。在乙醇固定單層包埋法中，我們將乙醇固定細(xì)胞沉淀物6 h，改為采用10%中性福爾馬林3 mL固定1 h，節(jié)省制作細(xì)胞塊時(shí)間。將該方法運(yùn)用到胃鏡、細(xì)針穿刺小標(biāo)本活檢包埋中，其方法簡(jiǎn)便安全且提高了工作效率，有效防止小標(biāo)本的丟失。

總之，在細(xì)胞塊制作中采用濾過膜與擦鏡紙雙層包埋法值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

[1] 黃雅萍，蔡路兵，翟梅娟，等. 胸腹水細(xì)胞沉渣包埋技術(shù)及應(yīng)用[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2004,20(1):112-113.

[2] 張 洋，車千紅， 閆祿春. TCT細(xì)胞標(biāo)本保存液及其濾過膜管在胸腹水細(xì)胞沉渣提取中的應(yīng)用[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2004,20(1):1410.

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1沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科，沈陽 1100242錦州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院2015級(jí)臨床醫(yī)學(xué)17班，錦州 1210003沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2013級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專業(yè)1班，沈陽 110020

程新宇，女，碩士，主任技師。Tel：(024)85715736，E-mail：cxy6816@126.com 王翠芳，女，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，教授，通訊作者。 E-mail：1310214448@qq.com

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1001-7399(2017)07-0818-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.07.031

接受日期：2017-05-20