索南昂秀+曹振宇+祁騰民

[摘要] 目的 探討TH17細(xì)胞及細(xì)胞因子在缺氧環(huán)境下在脊柱結(jié)核患者復(fù)發(fā)機(jī)制的影響。 方法 選擇2015年9月～2017年1月青海省人民醫(yī)院就診的脊柱結(jié)核病患者46例，依據(jù)臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查將其分為初發(fā)組（27例）和復(fù)發(fā)組（19例）。對患者TH17細(xì)胞及細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ進(jìn)行檢測，并對CCL20、CCL22、CCL27進(jìn)行檢測，觀察Th17細(xì)胞趨化指數(shù)變化及Th17細(xì)胞表達(dá)CCR受體及CCL配體的關(guān)系。 結(jié)果 與初發(fā)組比較，復(fù)發(fā)組患者的TH17細(xì)胞比例明顯升高（P < 0.05），細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α含量明顯上升（P < 0.01），IFN-γ含量下降（P < 0.01）。復(fù)發(fā)組CCL20、CCL22、CCL27的濃度明顯高于初發(fā)組（P < 0.01），免疫熒光染色及掃描定量分析發(fā)現(xiàn)CCL20、CCL22、CCL27在復(fù)發(fā)組患者的骨細(xì)胞中表達(dá)高于初發(fā)組（P < 0.01），細(xì)胞形態(tài)與初發(fā)組染色結(jié)果均相似。 結(jié)論 可將Th17細(xì)胞用于結(jié)核病及結(jié)核復(fù)發(fā)的診斷、結(jié)核病不同病程的區(qū)分及患者免疫功能的評估?？蓪L-6、IL-1β、IL-23、TNF-α、IFN-γ、CCL20、CCL22、CCL27、CCR受體及CCL配體作為缺氧條件下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)新的診斷標(biāo)志物，用于結(jié)核病復(fù)發(fā)的早期診斷。

[關(guān)鍵詞] 缺氧；TH17；脊柱結(jié)核；復(fù)發(fā)

[中圖分類號] R687.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（c）-0096-06

[Abstract] Objective To discuss the effect of TH17 cells and cytokines on the recurrence of spinal tuberculosis was evaluated in hypoxic environment. Methods From September 2015 to January 2017， in Qinghai People's Hospital， 46 patients with spinal tuberculosis were selected， they were divided into primary group （27 cases） and recurrence group （19 cases） according to clinical manifestation and laboratory examination. TH17 cells and cytokines including IL-6， IL-1β， IL-23， TNF-α， IFN-γ in patients and the CCL20， CCL22， CCL27 were detected. The relationship of chemotactic index of Th17 cells and the Th17 expression of CCR receptor and CCL ligand were evaluated. Results Compared with primary group， the percentage of TH17 cells increased significantly of patients in recurrence group （P < 0.05）， the content of cytokines including IL-6， IL-1， IL-23， TNF-α increased significantly （P < 0.01）， the content of IFN-γ decreased （P < 0.01）. The concentration of CCL20， CCL22 and CCL27 from recurrent group were significantly higher than primary group （P < 0.01）， immunofluorescence staining and scanning quantitative analysis showed that the expression of CCL20， CCL22 and CCL27 in bone cells of patients in recurrent group were higher than in primary group （P < 0.01）， cell morphology was similar with the the staining results of primary group. Conclusion Th17 cells can be used for the diagnosis of tuberculosis and tuberculosis recurrence， differentiation of tuberculosis courses and evaluation of immune function of patients. IL-6， IL-1β， IL-23， TNF-α， IFN-γ， CCL20， CCL22， CCL27， CCR receptors and CCL ligands can be used as a new diagnostic marker for the recurrence of spinal tuberculosis in hypoxia， and for the early diagnosis of tuberculosis recurrence.

[Key words] Hypoxia； TH17； Spinaltuberculosis； Recurrenceendprint

近些年來，結(jié)核病發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，且結(jié)核病情越來越趨于嚴(yán)重，該種疾病較為隱匿，一般嚴(yán)重時(shí)才被發(fā)現(xiàn)，故致殘率高，若早期不能得到發(fā)現(xiàn)并接受及時(shí)的治療，將會對患者、家庭及社會造成沉重的負(fù)擔(dān)。脊柱結(jié)核患者一般從肺部結(jié)核轉(zhuǎn)移發(fā)展而來，病情極為隱匿，該種疾病為結(jié)核性病變的最嚴(yán)重的表現(xiàn)形式，發(fā)病率約為所有結(jié)核病總數(shù)的45%[1]。相關(guān)研究表明脊柱結(jié)核病的骨性組織及血液中存在Th17細(xì)胞，尤以在脊柱結(jié)核病的骨性組織中濃度較高[2]。脊柱結(jié)核病患者體內(nèi)的Th17細(xì)胞的來源主要包括兩個(gè)途徑：①自身局部組織Th17細(xì)胞進(jìn)行分化增殖；②在CCL20-CCR受體、CCL22-CCR受體和CCL27-CCR受體趨化軸的作用下及成骨細(xì)胞的自身趨化作用下，將Th17細(xì)胞從患者血液中募集到達(dá)病骨組織中[3]。脊柱結(jié)核病的骨性組織及血液中的趨化因子受體及配體在炎癥因子的作用下表現(xiàn)為上調(diào)，其中上調(diào)Th17的細(xì)胞因子為IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α，而下調(diào)抑制細(xì)胞Th17的因子為IFN-γ[3]。

本項(xiàng)研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)觀察監(jiān)測在缺氧條件下IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ對Th17細(xì)胞的具體調(diào)節(jié)作用，以及CCL20、CCL22、CCL27、CCR受體及CCL配體對脊柱結(jié)核病復(fù)發(fā)的調(diào)節(jié)程度進(jìn)行研究監(jiān)測，以此探討在高原缺氧環(huán)境條件下脊柱結(jié)核病復(fù)發(fā)的原因與相關(guān)部分作用機(jī)制，從而為高海拔缺氧環(huán)境條件下的脊柱結(jié)核病的治療尋找以及提供基礎(chǔ)理論研究的基礎(chǔ)，而且為該類疾病的復(fù)發(fā)提供科學(xué)的監(jiān)測指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年9月～2017年1月青海省人民醫(yī)院就診的脊柱結(jié)核病患者46例，依據(jù)臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查將其分為初發(fā)組（27例）和復(fù)發(fā)組（19例）。初發(fā)組男14例，女13例，年齡25～72歲，平均（38.9±14.2）歲；復(fù)發(fā)組男10例，女9例，年齡30～68歲，平均（39.2±15.6）歲。兩組性別、年齡、淋巴細(xì)胞數(shù)等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。所有患者入院后進(jìn)行的TSPOT.TB結(jié)果和TST結(jié)果均為陽性，診斷均參照中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制訂的結(jié)核診斷和治療指南中的標(biāo)準(zhǔn)。所有脊柱結(jié)核病的患者，同時(shí)可伴有肺部結(jié)核（非活動期）及其他部位結(jié)核。其中臨床診斷包括脊柱磁共振及CT影像學(xué)陽性，而患者肺部影像學(xué)檢查結(jié)果則提示可能為肺結(jié)核相關(guān)性病變，且完善γ-干擾素試驗(yàn)（+）、結(jié)核菌素試驗(yàn)（TST）、抗結(jié)核抗體檢查陽性，經(jīng)診斷性治療有效后可伴有輕度咳嗽咳痰等肺結(jié)核可疑癥狀的病例；其他結(jié)核確診病例包括患者痰液涂片抗酸染色檢查（±），而培養(yǎng)結(jié)核桿菌（+）及病變部位病理學(xué)診斷為結(jié)核桿菌病變的病例[4-6]。同時(shí)排除肝、腎功能嚴(yán)重障礙性疾病的患者，自身免疫性疾病患者，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑的患者。

1.2 方法

1.2.1 Th17細(xì)胞的檢測

選取抗凝管（EDTA）對來自于高海拔地區(qū)缺氧條件下的脊柱結(jié)核病初發(fā)和復(fù)發(fā)的患者抽取靜脈血液6 mL，抽血時(shí)間均為該類患者住院并已經(jīng)確診后的次日清晨，確診條件為：①影像學(xué)資料及入院行結(jié)核菌素試驗(yàn)（+）；②完善γ-干擾素試驗(yàn)（+）。抽取患者的血液樣本必須嚴(yán)格控制于室溫下保存，以及抽血當(dāng)天必須及時(shí)進(jìn)行檢測。

1.2.1.1 樣本前處理 ①選用RPMI對已選取的250 μL全血標(biāo)本進(jìn)行1∶1等體積稀釋。②將稀釋液加入流式檢測的專用管中，并且依次加入：15 μL 1 μg/mL PMA工作液，10 μL 50 μg/mL Ionomycin工作液，6.6 μL 0.2 mg/mL Monensin工作液。將以上試驗(yàn)液進(jìn)行混勻，并放置于室溫條件下的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)長5～7 h。③將以上試驗(yàn)液從培養(yǎng)箱中取出后再依次加入：CD3-PC5 抗體10 μL，CD45-ECD 抗體10 μL，CD4-FITC 抗體10 μL，在室溫條件下將以上試驗(yàn)液避光孵育約15～20 min。④再將每個(gè)試驗(yàn)管中分別加入固定液（120 μL Fix&Perm中的Reagent A），并在室溫條件下避光孵育約15～20 min。⑤再將每管中分別加入4 mL PBS，取1000 g放入離心機(jī)離心8 min，并棄除上清。⑥再將每管中分別加入固定液（120 μL Fix&Perm中的Reagent B），同時(shí)各管中再分別加入相應(yīng)的IL-17-PE，將以上試驗(yàn)液在室溫下避光孵育10 min。⑦再將每管中分別加入3 mL PBS，取1000 g放入離心機(jī)離心8 min，并予以棄除上清。⑧最后選取1.0 mL PBS重懸細(xì)胞進(jìn)行上機(jī)檢測。

1.2.1.2 Th17 細(xì)胞上機(jī)檢測 ①選擇Navios操作菜單中的Th17細(xì)胞檢測程序；②以 CD45+CD3+的T淋巴細(xì)胞設(shè)置；③分析Th17細(xì)胞（CD4+IL-17+）的含量。

1.2.2 IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ的檢測

①選用枸櫞酸鈉抗凝管抽取高海拔地區(qū)缺氧環(huán)境下的脊柱結(jié)核病初發(fā)和復(fù)發(fā)患者靜脈血液6mL，抽血時(shí)間均為該類患者住院后并已經(jīng)確診后的次日清晨，確診條件為：影像學(xué)資料及入院行結(jié)核菌素試驗(yàn)（+）；完善γ-干擾素試驗(yàn)（+）。②抽取脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)患者靜脈血6 mL，取1000 g置于離心機(jī)進(jìn)行離心7 min后立即收集上清液250 μL，再將收集好的上清液進(jìn)行低溫凍存（-80℃）。③將待測樣本和鼠抗人IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ試劑盒恢復(fù)至室溫。④稀釋標(biāo)準(zhǔn)品并分別設(shè)置復(fù)孔加樣，每個(gè)濃度3孔，共計(jì)15孔。并分別設(shè)置空白對照孔，待測樣本孔。⑤再于酶標(biāo)板上首先加入已經(jīng)稀釋的樣本液體40 μL，然后再加入15 μL樣本，并在恒溫水浴箱中封板孵育40 min，揭開封板膜并且棄去液體，甩干，再于每孔中加入已經(jīng)稀釋好的洗滌液并且靜置25 s后棄去。⑥再于每孔中分別加入IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ酶標(biāo)試劑液體40 μL（空白孔除外）。⑦再選用封板膜封板，并放置于恒溫水浴箱中，孵育時(shí)間約為25 min，仔細(xì)揭開封板膜并且拋去液體，甩干，再于每孔加入稀釋好的洗滌液并且靜置25 s后拋去。⑧再于每孔中分別加入40 μL的顯色劑A，再加入40 μL的顯色劑B，混勻后再留置于室溫條件下進(jìn)行避光顯色20 min。⑨再于每孔分別加入40 μL終止液予以終止反應(yīng)，立即予以酶標(biāo)儀進(jìn)行450 nm波長測定吸光度（OD）值。⑩最后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品已知濃度擬合曲線換算出各樣本中IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ的含量，所有檢測報(bào)告均以（ng/L）為單位[7]。endprint

1.2.3 CCL20、CCL22、CCL27、CCR受體及CCL配體的檢測分析

采用ELISA的方法對CCL20、CCL22、CCL27在進(jìn)行了檢測；采用免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察成骨細(xì)胞表達(dá)CCL20、CCL22、CCL27的細(xì)胞形態(tài)。

具體方法：①提取缺氧條件下的脊柱結(jié)核初發(fā)患者和復(fù)發(fā)患者的病變部位骨組織；②從骨組織中分離提取出成骨細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后取出并進(jìn)行初次漂洗固定；③再次漂洗后滴加血清液并進(jìn)行孵育，并分別滴加CCL20、CCL22、CCL27抗體并進(jìn)行過夜（溫度進(jìn)行控制）；④再次漂洗，并滴加標(biāo)記的免疫熒光二抗進(jìn)行避光孵育，1 h后漂洗；⑤封片后置于激光共聚焦顯微鏡下，在波長488 nm的激發(fā)下進(jìn)行比較觀察；⑥使用Image-Pro plus軟件分別對初發(fā)組和復(fù)發(fā)組的骨細(xì)胞CCL20、CCL22、CCL27進(jìn)行掃描測定。

檢測脊柱結(jié)核患者初發(fā)組和復(fù)發(fā)組病骨細(xì)胞表面表達(dá)的CCR4細(xì)胞比例，以及分別加入α-CCL20、α-CCL22及α-CCL27后Th17細(xì)胞的趨化性表現(xiàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。通過 ROC 曲線評價(jià)各指標(biāo)用于區(qū)分結(jié)核病不同病程的診斷效益。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 初發(fā)組和復(fù)發(fā)組Th17細(xì)胞的表達(dá)情況

復(fù)發(fā)組Th17細(xì)胞的比例[（13.08±0.70）%]明顯高于初發(fā)組[（11.31±0.40）%）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 初發(fā)組和復(fù)發(fā)組的IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ表達(dá)情況

復(fù)發(fā)組IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α的表達(dá)明顯高于初發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而IFN-γ的表達(dá)低于初發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。這一變化趨勢和Th17細(xì)胞的變化趨勢相同，說明Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ在抗結(jié)核感染過程中的重要作用。

2.3 初發(fā)組和復(fù)發(fā)組CCL20、CCL22、CCL27的表達(dá)情況

復(fù)發(fā)組CCL20、CCL22、CCL27的濃度明顯高于初發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。說明CCL20、CCL22、CCL27在缺氧狀態(tài)下對Th17細(xì)胞的趨化作用起到了重要的作用。

2.4 免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察成骨細(xì)胞表達(dá)CCL20、CCL22、CCL27的細(xì)胞形態(tài)

免疫熒光染色結(jié)果：CCL20、CCL22、CCL27在復(fù)發(fā)組患者的成骨細(xì)胞中表達(dá)較初發(fā)組為高，細(xì)胞形態(tài)與初發(fā)組染色結(jié)果相似。經(jīng)免疫熒光染色鑒定，CCL20、CCL22、CCL27在缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)患者骨組織中明顯多于初發(fā)組。見圖1（封三）。

2.5 初發(fā)組和復(fù)發(fā)組CCL20、CCL22、CCL27的定量分析

復(fù)發(fā)組骨細(xì)胞中CCL20、CCL22、CCL27的相對光密度值明顯高于初發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

2.6 初發(fā)組和復(fù)發(fā)組中Th17細(xì)胞趨化比例情況

脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)組病骨細(xì)胞表面表達(dá)的CCR4細(xì)胞比例為（67.3±4.9）%，初發(fā)組為（52.6±5.5）%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。說明復(fù)發(fā)組患者骨細(xì)胞中的細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)顯著高于初發(fā)組。

Th17細(xì)胞趨化指數(shù)變化：初發(fā)組分別加入α-CCL20、α-CCL22及α-CCL27后較復(fù)發(fā)組Th17細(xì)胞趨化性均減弱，細(xì)胞趨化指數(shù)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表4。

3 討論

目前隨著全世界醫(yī)學(xué)領(lǐng)域外科學(xué)技術(shù)和外科內(nèi)固定技術(shù)的不斷高速的發(fā)展，外科手術(shù)方案逐漸成為治療脊柱結(jié)核并患者的首選方法，這是近幾十年來在治療脊柱結(jié)核病方面的一大突破性進(jìn)展，常規(guī)條件下在對于此類患者進(jìn)行有效的抗結(jié)核藥物的治療基礎(chǔ)之上，尚可以采取對具備局部手術(shù)指征的脊柱結(jié)核病患者進(jìn)行及時(shí)而且有效的外科手術(shù)干預(yù)治療，從而達(dá)到徹底清除病灶組織、穩(wěn)定牢固的脊柱內(nèi)固定支持和充分的病變部位椎體植骨融合[9-10]。

及時(shí)而有效的外科手術(shù)干預(yù)治療可良好控制脊柱結(jié)核病灶在病椎局部及軟組織的腐蝕擴(kuò)散，防止早期出現(xiàn)脊柱后突畸形，甚至防止早期出現(xiàn)癱瘓癥狀，以及對于已經(jīng)出現(xiàn)脊柱后突畸形的患者進(jìn)行脊柱矯正都具有積極的臨床意義，但手術(shù)干預(yù)治療結(jié)束后由于各種原因?qū)е录怪Y(jié)核病的復(fù)發(fā)而需要再次手術(shù)甚至多次手術(shù)的患者也在逐年增多[11]。

青海省深處我國的內(nèi)陸，屬于青藏高原地區(qū)，平均海拔在2500 m左右，大部分地區(qū)海拔更高，長期處于高原缺氧環(huán)境，這里因交通不便，相對閉塞，導(dǎo)致醫(yī)療資源匱乏，衛(wèi)生條件相對內(nèi)省較差，且該地區(qū)為多種族地區(qū)，相互種族之間的語言溝通存在一定障礙，各族生活習(xí)慣相差較大等等，從而導(dǎo)致該地區(qū)的大部分疾病患者普遍缺乏醫(yī)療保健意識，時(shí)常延誤病情，早期不能發(fā)現(xiàn)及治療，導(dǎo)致肺結(jié)核病及脊柱結(jié)核病在發(fā)病的早期階段常常沒有得到足夠的重視，喪失了最佳的治療機(jī)會，大大增加了治療難度，而且術(shù)后該地區(qū)此類患者的營養(yǎng)條件普遍欠缺，生活衛(wèi)生環(huán)境較差，種種因素均導(dǎo)致脊柱結(jié)核病在術(shù)后復(fù)發(fā)較為常見，且手術(shù)治療后的復(fù)發(fā)率呈逐漸上升趨勢。相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)[12-13]由于結(jié)核分支桿菌具備頑強(qiáng)的生命力以及具備復(fù)雜的免疫機(jī)制，極為隱匿，侵蝕范圍較廣，所以自其被人類研究發(fā)現(xiàn)至今一直未能得到及時(shí)而有效的控制，尤其是近十幾年來結(jié)核病蔓延至人體脊柱骨性組織的發(fā)病率有所抬頭上升，這就使得脊柱結(jié)核病在現(xiàn)階段呈現(xiàn)出死灰復(fù)燃的跡象[14-15]。已知人體免疫機(jī)制中的CD4+T細(xì)胞在抗結(jié)核感染細(xì)胞免疫中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用[16-17]，在人體內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞因子協(xié)調(diào)作用下初始CD4+T細(xì)胞，使其分化為Th17細(xì)胞[18]，并且分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子（如IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α、IFN-γ、CCL20、CCL22、CCL27、CCR受體及CCL配體等），從而達(dá)到促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生炎性反應(yīng)[19]。endprint

目前，關(guān)于在高原缺氧環(huán)境條件下IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ對人體內(nèi)的Th17細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用甚為稀少，且關(guān)于CCL20、CCL22、CCL27、CCR受體及CCL配體在脊柱結(jié)核病復(fù)發(fā)的研究尚無研究報(bào)道。國內(nèi)外的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)許多疾病的發(fā)生和發(fā)展中類似于此類細(xì)胞的數(shù)量與功能存在著十分密切的關(guān)系，并且發(fā)揮著巨大的作用[20-21]。過去十幾年的國內(nèi)及國外相關(guān)人員研究發(fā)現(xiàn)，脊柱結(jié)核病和正常未患病對照相比，細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α含量略為升高[22-23]。

但本研究尚發(fā)現(xiàn)在高原缺氧環(huán)境條件下復(fù)發(fā)的脊柱結(jié)核感染患者體內(nèi)的細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α的表達(dá)較初發(fā)組明顯增加，而細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)較初發(fā)組明顯降低，考慮這種現(xiàn)象可能與機(jī)體長期處于缺氧狀態(tài)，以及結(jié)核分枝桿菌的不斷刺激，均導(dǎo)致了體內(nèi)的效應(yīng)T細(xì)胞在原本正常的細(xì)胞增殖活化過程中受到明顯抑制，因此通過該項(xiàng)研究可以推測出IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ細(xì)胞可作為評估在缺氧環(huán)境條件下脊柱結(jié)核患者是否存在復(fù)發(fā)可能性的免疫功能指標(biāo)。此外，本研究尚監(jiān)測發(fā)現(xiàn)CCL20、CCL22、CCL27在缺氧環(huán)境條件下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)患者及初發(fā)患者體內(nèi)含量存在明顯的差異性，可考慮將其作為缺氧環(huán)境條件下脊柱結(jié)核病復(fù)發(fā)的觀察指標(biāo)。最后，本項(xiàng)研究觀察缺氧環(huán)境條件下脊柱結(jié)核初發(fā)組和復(fù)發(fā)組中CCR4受體變化水平及在CCL配體作用下Th17細(xì)胞的趨化指數(shù)變化，CCR4受體變化存在差異性，而Th17細(xì)胞的趨化指數(shù)變化明顯，故也可考慮將CCR4受體及CCL配體作為判斷缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)的輔助指標(biāo)。

人體內(nèi)的Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-23等通過研究發(fā)現(xiàn)可明顯提高宿主的抵抗能力[24]，且這些細(xì)胞因子均在多種細(xì)菌感染中發(fā)揮著重要作用[25]?，F(xiàn)階段的國內(nèi)及國外關(guān)于Th17細(xì)胞在脊柱結(jié)核病中的發(fā)揮作用的研究報(bào)道稀少[26]，尚存在不少差異，且關(guān)于缺氧狀態(tài)下的報(bào)道尚無，有大部分學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞的大量表達(dá)和脊柱結(jié)核病的嚴(yán)重程度呈正比例[27]，也有小部分學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性脊柱結(jié)核患者體內(nèi)的Th17細(xì)胞的表達(dá)受到明顯的抑制[28]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境條件下的復(fù)發(fā)性結(jié)核患者體內(nèi)的Th17細(xì)胞及大多數(shù)細(xì)胞因子數(shù)量顯著高于初發(fā)性脊柱結(jié)核患者，而IFN-γ數(shù)量低于初發(fā)性脊柱結(jié)核患者。所以可以推測缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)性患者機(jī)體固有免疫被激活，同時(shí)分泌大量細(xì)胞因子刺激Th17細(xì)胞增殖進(jìn)而引起一系列免疫病理損傷，與此同時(shí)IFN-γ對于抑制Th17 細(xì)胞的作用在不斷減弱[28-30]。也有相關(guān)國外研究報(bào)道人體內(nèi)Th17細(xì)胞及分泌的細(xì)胞因子IL-6、IL-1β及IL-23并不一定參與了機(jī)體抗結(jié)核的免疫病理損傷[31]，這可能與人體的免疫應(yīng)答能力存在一定關(guān)聯(lián)，通過本項(xiàng)研究，我們可以發(fā)現(xiàn)在高海拔地區(qū)缺氧環(huán)境條件下的人體內(nèi)的CD4+T細(xì)胞與脊柱結(jié)核病從初發(fā)到復(fù)發(fā)的不同疾病進(jìn)展階段具有緊密的相關(guān)性，這就說明了人體T細(xì)胞免疫應(yīng)答能力與脊柱結(jié)核病的復(fù)發(fā)具有直接作用[32]。

本研究通過直接檢測缺氧環(huán)境條件下的脊柱結(jié)核病患者的外周血中Th17細(xì)胞及細(xì)胞因子（IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α、IFN-γ、CCL20、CCL22、CCL27、CCR受體及CCL配體）的含量，反映出了機(jī)體的最直接最實(shí)際的免疫情況。此外，尚有一些研究人員通過結(jié)核特異性抗原刺激后外周血后再檢測，也可反應(yīng)機(jī)體免疫應(yīng)答狀況，但該方面的研究尚未明確結(jié)論，有待進(jìn)一步的研究探索。①通過流式細(xì)胞術(shù)對高原缺氧條件下脊柱結(jié)核感染不同病程時(shí)期患者外周血中Th17細(xì)胞的檢測發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞在高原缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)患者中的表達(dá)量明顯高于初發(fā)患者（P < 0.05），提示可將Th17細(xì)胞用于結(jié)核病及結(jié)核復(fù)發(fā)的診斷、結(jié)核病不同病程的區(qū)分及患者免疫功能的評估。②通過Luminex技術(shù)對結(jié)核免疫標(biāo)志物的檢測發(fā)現(xiàn)免疫標(biāo)志物IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α在缺氧條件下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)感染患者中的表達(dá)量明顯高于脊柱結(jié)核初發(fā)患者組（P < 0.05），而IFN-γ在缺氧條件下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)感染患者中的表達(dá)量低于脊柱結(jié)核初發(fā)患者組（P < 0.05），提示可將IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ均作為缺氧條件下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)新的診斷標(biāo)志物，用于高海拔地區(qū)脊柱結(jié)核病復(fù)發(fā)的早期篩查及診斷。③通過ELISA方法對CCL20、CCL22、CCL27進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組CCL20、CCL22、CCL27的濃度明顯高于初發(fā)組（P < 0.05），從而證實(shí)了CCL20、CCL22、CCL27在缺氧狀態(tài)下對Th17細(xì)胞的趨化作用起到了重要的作用。故可考慮將CCL20、CCL22、CCL27作為缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)的指標(biāo)。④通過免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察成骨細(xì)胞表達(dá)CCL20、CCL22、CCL27的細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCL20、CCL22、CCL27在復(fù)發(fā)組患者的成骨細(xì)胞中表達(dá)較初發(fā)組為高，細(xì)胞形態(tài)與初發(fā)組染色結(jié)果相似，經(jīng)免疫熒光染色鑒定，CCL20、CCL22、CCL27在缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)患者骨組織中明顯多于初發(fā)組。故可考慮將CCL20、CCL22、CCL27作為缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)的指標(biāo)。⑤通過軟件測試明確了在復(fù)發(fā)組骨細(xì)胞中CCL20、CCL22、CCL27的相對光密度值明顯高于初發(fā)組。故提示可將CCL20、CCL22、CCL27用于結(jié)核病及結(jié)核復(fù)發(fā)的診斷、結(jié)核病不同病程的區(qū)分及患者免疫功能的評估。⑥通過檢測缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核初發(fā)組和復(fù)發(fā)組中CCR4受體變化水平及在CCL配體作用下Th17細(xì)胞的趨化指數(shù)變化，CCR4受體變化存在差異性，而Th17細(xì)胞的趨化指數(shù)變化明顯，故也可考慮將CCR4受體及CCL配體作為判斷缺氧環(huán)境下脊柱結(jié)核復(fù)發(fā)的輔助指標(biāo)。endprint

綜上所述，人體內(nèi)的CD4+T細(xì)胞的不斷分化以及發(fā)育對于人體的免疫調(diào)節(jié)功能和防御能力的平衡具有相當(dāng)重要的意義，其中部分Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子（如IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α、CCL20、CCL22、CCL27、CCR受體及CCL配體等）均起到了促進(jìn)炎癥和加強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用，而小部分細(xì)胞因子對于Th17細(xì)胞的抑制作用也在減弱（如IFN-γ）。本研究通過對多種免疫標(biāo)志物的同時(shí)檢測，不僅有效提升了高海拔地區(qū)脊柱結(jié)核病初發(fā)及復(fù)發(fā)診斷的陽性率，同時(shí)將有助于判斷脊柱結(jié)核病患者在不同病程時(shí)期的真實(shí)免疫狀況，為臨床醫(yī)師對脊柱結(jié)核病的篩查診斷以及治療方案的調(diào)整加之患者免疫功能的評估提供了準(zhǔn)確的科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2017-05-15 本文編輯：蘇 暢）endprint