武鳳梅 何佳

哈爾濱瀚邦醫(yī)療科技有限公司 150028

RP-HPLC法測(cè)定枸櫞酸離子檢驗(yàn)條件研究

武鳳梅 何佳

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目的：考察血液制品與磺基水楊酸的反應(yīng)溫度對(duì)枸櫞酸離子含量檢驗(yàn)結(jié)果的影響。方法：首先通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定樣品溫度對(duì)枸櫞酸離子含量的結(jié)果的影響，再根據(jù)確定的反應(yīng)溫度，依據(jù)《中國(guó)藥典》（2015年版）進(jìn)行方法學(xué)研究。結(jié)果：樣品與磺基水楊酸的反應(yīng)溫度為37℃時(shí)，方法學(xué)研究符合相關(guān)規(guī)定。結(jié)論：為保證樣品與磺基水楊酸反應(yīng)完全，結(jié)果真實(shí)可靠，樣品與磺基水楊酸的反應(yīng)溫度設(shè)定為37℃。

枸櫞酸離子；血液制品與磺基水楊酸的反應(yīng)溫度

《中國(guó)藥典》2015版三部[1]中枸櫞酸離子含量測(cè)定法有三個(gè)方法，其中第二法高效液相法是用示差折光檢測(cè)器，通過(guò)苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基質(zhì)的陽(yáng)離子交換色譜柱（H+）將血液制品中的枸櫞酸離子分離出來(lái)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中磺基水楊酸與樣品反應(yīng)條件直接影響枸櫞酸離子的分離效果，不同檢驗(yàn)條件對(duì)檢驗(yàn)枸櫞酸離子含量結(jié)果影響較大[2-5]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同溫度條件及反應(yīng)時(shí)間的考察，確定血液制品樣品與磺基水楊酸的反應(yīng)具體條件。

1.儀器與試劑

高效液相色譜儀：示差折光檢測(cè)器（島津RID-10A），

試劑：枸櫞酸鈉（SIGMA）：批號(hào)：BCBP0175V

硫酸、磺基水楊酸為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2.色譜條件

2.1.色譜條件：陽(yáng)離子交換色譜柱（H+）：BIO（300mm× 7.8mm，9um）；流動(dòng)相為0.004mol/L硫酸，流速0.8ml/min；柱溫50℃。

3.溶液的配制及樣品處理：

3.1.對(duì)照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)減壓干燥至恒重的枸櫞酸鈉0.735g，置100ml量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，精密量取5ml、10ml、15ml，分別置25ml量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得相對(duì)應(yīng)的5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L枸櫞酸離子對(duì)照品溶液[6,7]。分別精密量取20uL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；

3.2.供試品溶液的制備：取血液制品的供試品溶液 1ml，置15ml離心管中，精密加入1.5%磺基水楊酸溶液 1ml，搖勻，37℃靜置2h，以每分鐘2000離心10分鐘，取上清液，過(guò)濾，同法測(cè)定。

3.3.以對(duì)照品溶液的枸櫞酸離子濃度對(duì)其相應(yīng)的峰面積作直線回歸，求得直線回歸方程，計(jì)算出供試品溶液中枸櫞酸離子含量（mmol/L），再乘以相應(yīng)的供試品稀釋倍數(shù)2，計(jì)算出供試品中枸櫞酸離子含量（mmol/L）。

4.實(shí)驗(yàn)過(guò)程

4.1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模嚎紤]到季節(jié)變化對(duì)室溫的影響較大，考察樣品與1.5%磺基水楊酸的反應(yīng)溫度是否會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果。

4.1.1.考察25℃、37℃、50℃時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否產(chǎn)生影響，以某血液制品的不同批號(hào)的樣品為例：

表1 三批樣品與磺基水楊酸的不同反應(yīng)溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，樣品與 1.5%磺基水楊酸的反應(yīng)溫度會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，而反應(yīng)溫度為40℃時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更接近理論值，因此對(duì)反應(yīng)溫度為37℃時(shí)繼續(xù)進(jìn)一步研究。

4.2.線性關(guān)系考察：按照“3.1”項(xiàng)下的步驟對(duì)和對(duì)照品進(jìn)行處理，并取不同濃度的對(duì)照品 20ul進(jìn)樣分析，其線性回歸方程為y=44906.6x+584.732 r=1.0

因此對(duì)照品的濃度適用于該濃度的樣品測(cè)定。

4.3.精密度：取中間濃度的枸櫞酸離子對(duì)照品，連續(xù)進(jìn)樣 5次，枸櫞酸離子的保留時(shí)間RSD＜0.1%，峰面積的RSD＜0.1%，精密度符合色譜條件的規(guī)定。

4.4.重復(fù)性：按“3.2”的操作處理某一批樣品，重復(fù)6次，計(jì)算同一批次樣品的6個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，6個(gè)數(shù)據(jù)的枸櫞酸離子的含量RSD為0.8%。重復(fù)性良好。

4.5.準(zhǔn)確度：在樣品中，加入80%、100%、120%的對(duì)照品溶液，計(jì)算回收率，結(jié)果如下表：

表2 回收率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

準(zhǔn)確度良好。

4.6.中間精密度：不同化驗(yàn)員對(duì)同一批次樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，同一化驗(yàn)員不同時(shí)間對(duì)同一批次樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，相對(duì)偏差均符合規(guī)定。

5.結(jié)果與結(jié)論：根據(jù)以上方法學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，枸櫞酸離子含量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與樣品和磺基水楊酸在37℃條件下，反應(yīng)2h的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度更準(zhǔn)確[8]，因此反應(yīng)條件定位37℃、2h。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].四部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：通則3108.

[2]王欣美,毛秀紅,王柯.離子色譜法同時(shí)測(cè)定中藥注射劑中亞硫酸鹽及枸櫞酸含量的研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2012(3):64-66.

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