王華民 齊平建 于 東 董虹廷 史 進 及時雨 劉 睿 李欽濤

(鄭州大學附屬南陽醫(yī)院 南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 南陽 473000)

α1整合素活化在β淀粉樣蛋白誘導神經(jīng)細胞死亡中的作用

王華民 齊平建 于 東 董虹廷 史 進 及時雨 劉 睿 李欽濤

(鄭州大學附屬南陽醫(yī)院 南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 南陽 473000)

目的探討神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)中β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路活化的上游影響因素。方法選擇SH-SY5Y為靶細胞，首先用MAPK信號通路上游抑制劑處理細胞，待細胞培養(yǎng)1 h之后，加入Aβ42纖維聚集體，細胞培養(yǎng)24 h后進行檢測。首先采用甲氮甲唑藍(MTT)法測定了細胞的存活率，然后利用Western印跡檢測磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK)和ERK的蛋白表達水平，從而檢測MAPK信號通路的激活水平。結(jié)果用鋸鱗血抑肽或α1整合素蛋白封閉性抗體可以有效抑制Aβ引起的細胞死亡，并且阻止Aβ成纖維誘導MAPK的激活水平的提高(P<0.05)。用α1和β1整合素蛋白封閉抗體同時作用細胞時，得到了相似的結(jié)果。但是如果只用β1整合素蛋白封閉抗體單獨作用細胞時，不能阻止Aβ成纖維誘導細胞死亡和MAPK的激活水平的提高。結(jié)論α1整合素，α1和β1整合素復合體是Aβ誘導SH-SY5Y細胞中MAPK信號通路激活從而介導細胞死亡的重要因素。推測α1整合素蛋白和α1、β1復合體可以作為治療性干擾Aβ信號通路的靶點。

整合素；黏著斑激酶；神經(jīng)突變性；細胞死亡

淀粉樣蛋白(Aβ)在細胞外的沉積與tau蛋白的過度磷酸化有著密不可分的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ在作用多種細胞引入神經(jīng)毒性的同時伴隨著絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活〔1〕。同時，當成熟的海馬神經(jīng)元與MAPK抑制因子共同孵育，可以抑制tau蛋白的過度磷酸化和神經(jīng)突觸退變〔2〕。本文采用了α1整合素蛋白抑制因子，β1整合素蛋白抑制因子和α1、β1整合素復合物蛋白抑制因子分別作用細胞，從而進一步研究這些整合素蛋白在Aβ誘導MAPK信號通路激活中的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 Aβ(1～42)肽、六氟異丙醇(HFIP)購自Sigma公司；整合素α1封閉抗體(α1整合素抑制劑)和整合素β1封閉抗體(β1整合素抑制劑)購自Santa Cruz；鼠抗人細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)抗體和兔抗人p-ERK抗體購自Santa Cruz；鼠抗人黏著斑激酶(FAK)抗體和兔抗人p-FAK抗體購自Santa Cruz；抗兔IgG(抗p-ERK抗體和抗p-FAK抗體)和抗鼠IgG(抗ERK抗體和抗FAK抗體)購自Santa Cruz；Tubulin購自Santa Cruz；辣根過氧化物酶標記的增強型化學發(fā)光試劑(碧云天)；甲氮甲唑藍(MTT)購自Sigma公司；鋸鱗血抑肽(E)購自Sigma公司；SH-SY5Y細胞購于German Collection of Microorganisams and Cell Cultures;青霉素和鏈霉素購自Sigma公司；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購于GIBCO。

1.2細胞培養(yǎng) 神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)培養(yǎng)于添加10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，放入5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長到80%左右進行細胞傳代培養(yǎng)，加入適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗除去未貼壁的細胞，加入1 ml 0.25%的胰蛋白酶室溫消化，細胞變圓后用彎頭滴管加入新鮮的培養(yǎng)液吹打瓶壁進行細胞重懸，按1∶3比例進行傳代以備后續(xù)實驗所用。根據(jù)所做實驗對細胞量的要求計數(shù)后分別把細胞傳到培養(yǎng)瓶，96孔板、24孔板或6孔板進行培養(yǎng)。

1.3Aβ纖維聚集體的制備及鑒定 將Aβ1～42無菌條件下溶解于1 mg/ml的HIFP，水浴超聲10 min，真空干燥，-20℃凍存。使用時現(xiàn)將Aβ42用二甲基亞砜(DMSO)溶解至1 mg/ml，再將Aβ42稀釋到終濃度為10 μmol/L的PBS中，終濃度為20 mol/L，在37℃孵育6 d形成纖維聚集狀態(tài)。然后通過透射電子顯微鏡觀察確認其聚集狀態(tài)。Aβ42纖維聚集體的制備和聚集體結(jié)構(gòu)的透射電鏡形態(tài)參考文獻〔3〕。由于Aβ42形成聚集體的不可逆性，Aβ42纖維的使用均為先用先制備，若短期使用置于-80℃儲存。

1.4MTT法檢測細胞的存活率 取對數(shù)生長期細胞，以每孔 2×103個細胞(100 μl)的數(shù)量接種在96孔板培養(yǎng)24 h，根據(jù)實驗要求分別將鋸鱗血抑肽(整合素的一個抑制子)，α1整合素抑制劑，β1整合素抑制劑，α1+β1整合素抑制劑加入不同的培養(yǎng)孔中(設(shè)置兩組平行實驗：實驗組1和實驗組2)，終濃度為2 μmol/L，5%CO2條件下培養(yǎng)1 h。向?qū)嶒灲M1和實驗組2中分別加入相同體積的Aβ纖維聚集體和含10%胎牛血清的DMEM。其中，實驗組1中Aβ纖維聚集體的終濃度為20 μmol/L，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。同時設(shè)置不含有整合素抑制劑、Aβ纖維聚集體和只加入20 μmol/L Aβ纖維聚集體的對照實驗組。細胞在處理完畢后，每孔加入5 g/L MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，加入DMS 150 μl充分溶解，待甲臜完全溶解后，用酶標儀(Bio-Tek,ELX800)在波長490 nm處讀取吸光度(A490)值。

1.5抑制整合素的活性 首先，將鋸鱗血抑肽(整合素的一個抑制子)加入達到對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞中，調(diào)節(jié)終濃度2 μmol/L，孵育1 h后時加入Aβ纖維聚集體(20 μmol/L)，孵育24 h。另設(shè)一實驗組，將鋸鱗血抑肽換成整合素封閉抗體作用于達到對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，調(diào)節(jié)終濃度2 μmol/L，孵育1 h時后加入Aβ纖維聚集體(20 μmol/L)，孵育24 h。通過MTT實驗和免疫印跡實驗分別檢測細胞的存活率和分析蛋白ERK和p-ERK的表達量。

1.6Western印跡檢測目的蛋白 SH-SY5Y細胞經(jīng)2 μmol/L鋸鱗血抑肽，2 μmol/L α1整合素抑制劑，2 μmol/L β1整合素抑制劑，2 μmol/L α1+2 μmol/L β1整合素抑制劑作用1 h和2 μmol/L鋸鱗血抑肽，2 μmol/L α1整合素抑制劑，2 μmol/L β1整合素抑制劑，2 μmol/L α1+2 μmol/L β1整合素抑制劑作用1 h，20 μmol/L Aβ纖維聚集體作用24 h后 ，提取細胞蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質(zhì)濃度。各組取50 μg總蛋白上樣，經(jīng) 12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，80 V轉(zhuǎn)膜 90 min。5%脫脂牛奶-PBST 封閉 2 h；分別加入以下一抗：ERK(1∶800)，p-ERK(1∶1 000)，F(xiàn)AK(1∶800)，p-FAK(1∶1 000)和Tubulin(1∶5 000 稀釋)，4℃搖床上孵育過夜。次日洗膜，加入二抗(羊抗兔和羊抗鼠，1∶10 000 稀釋)，室溫孵育2～3 h。洗膜后，采用辣根過氧化物酶標記的增強型化學發(fā)光法顯色，顯影于X光片上。采用 LabWorks4.6軟件對目的蛋白和Tubulin 條帶行灰度值分析。

1.7統(tǒng)計學方法 使用SPSS軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1鋸鱗血抑肽對Aβ42纖維誘導SH-SY5Y細胞死亡的影響 以20 μmol/L Aβ42纖維處理細胞24 h后，與未經(jīng)處理的細胞相比，細胞的存活率明顯降低。如果用2 μmol/L的鋸鱗血抑肽作用細胞1 h，20 μmol/L的Aβ42纖維處理細胞24 h后，細胞的存活率(73.54±0.02)與單獨用20 μmol/L Aβ42纖維作用的對照組(29.23±0.01)相比發(fā)生明顯提高，這說明通過抑制MAPK信號通路可以有效抑制Aβ42纖維所誘導的細胞死亡。

2.2MAPK在SH-SY5Y中的表達水平 與對照組(鋸鱗血抑肽和Aβ42纖維聚集體濃度為0)比較，單獨用Aβ42纖維聚集體作用細胞24 h后，細胞中p-ERK水平要高于對照組(54.32±0.001)%(P<0.05)。用2 μmol/L鋸鱗血抑肽單獨作用細胞1 h，用2 μmol/L鋸鱗血抑肽和20 μmol/L Aβ42纖維聚集體分別作用細胞1 h和24 h后，細胞中p-ERK水平相近，分別為(49.84±0.01)%和(55.47±0.02)%均低于對照組(P<0.05)。見圖1。

圖1 鋸鱗血抑肽(E)抑制Aβ誘導 SH-SY5Y細胞中MAPK的激活

2.3MTT檢測整合素封閉抗體對SH-SY5Y細胞存活率的影響 當以20 μmol/L Aβ42纖維聚集體為細胞胞外基質(zhì)作用細胞24 h，細胞的存活率為對照組的(0.30±0.01)倍(P<0.05)。所得的實驗結(jié)果與2 μmol/L β1整合素封閉抗體和20 μmol/L Aβ42纖維聚集體分別作用細胞1 h和24 h得到的實驗結(jié)果相近。但是，如果單獨用2 μmol/L β1整合素封閉抗體作用細胞1 h，細胞的存活率為照組的(0.70±0.02)倍(P<0.05)。明顯高于以Aβ42纖維聚集體，β1整合素封閉抗體和Aβ42纖維聚集體為胞外基質(zhì)時細胞的存活率。用2 μmol/L α1整合素封閉抗體孵育細1 h，2 μmol/L α1整合素封閉抗體孵育細胞1 h和20 μmol/L Aβ42纖維聚集體孵育細胞24 h得到的細胞存活率分別為照組的(0.80±0.02)倍和(0.77±0.03)倍(P<0.05)。與β1整合素封閉抗體單獨作用細胞得到的結(jié)果相似。當用2 μmol/L α1整合素封閉抗體和β1整合素封閉抗體共同孵育細1 h所得的結(jié)果與用2 μmol/L α1+2 μmol/L β1整合素封閉抗體共同孵育細1 h和20 μmol/L Aβ42纖維聚集體孵育細胞24 h得到的細胞存活率相近，分別為照組的(0.99±0.03)倍和(0.97±0.03)倍(P<0.05)。

2.4α1整合素在Aβ42寡聚體所誘導MAPK激活中的作用 獨用Aβ42(20 μmol/L)作用細胞24 h后，細胞中p-ERK的蛋白表達量最高，而用2 μmol/L α1+2 μmol/L β1整合素封閉抗體共同孵育細1 h后，細胞中p-ERK的蛋白表達量最低。以p-ERK/ERK的蛋白比值為標準，各組數(shù)據(jù)分別為100%，(149.23±0.01)%，(48.34±0.02)%,(45.45±0.02)%，(47.21±0.03)%，(45.67±0.01)%，(19.45±0.04)%，(21.54±0.02)%。見圖2。

FAK通常與整合素共定位，并通過與特異性的配體結(jié)合而活化?；罨腇AK中397位的酪氨酸會發(fā)生磷酸化。根據(jù)免疫印跡的實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)實驗組的FAK磷酸化水平與對照組相比沒有明顯變化。見圖3。

圖2 整合素封閉抗體抑制Aβ誘導 SH-SY5Y細胞中MAPK的激活

圖3 Aβ42纖維對SH-SY5Y中FAK活化水平的影響

3 討 論

整合素是細胞表面受體的主要家族。對細胞和細胞外基質(zhì)的黏附起介導作用。在受損傷的神經(jīng)細胞中發(fā)現(xiàn)淀粉樣前體蛋白(APP)和整合素在神經(jīng)細胞中有共定位。例如，在海馬神經(jīng)元中，APP與α1β1整合素異二聚體存在共定位。整合素異二聚體是由α1，α3，α5，α6和β1整合素所形成的〔4〕。Bi等〔5〕研究表明，抑制海馬神經(jīng)元整合素的表達將會引起Aβ的大量積累，對不同的細胞模型進行研究時發(fā)現(xiàn)，整合素在Aβ介導的細胞凋亡過程中也起到重要的作用。在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中，通過對β1整合素的抑制可以抑制Aβ刺激產(chǎn)生的活性氧〔6〕。在成熟的神經(jīng)細胞中，Aβ纖維引起MAPK活化的峰值在細胞暴露給Aβ纖維24 h之后，這與生長因子所引起的瞬間激活不同〔7〕。同時在MAPK激活之后的1 h仍然處于活化狀態(tài)〔8〕。這表明Aβ引起的MAPK活的活化是漸進的并且具有持續(xù)性。這種MAPK的激活模式是由于細胞外基質(zhì)中的蛋白與細胞上的受體結(jié)合所介導的。Zhu等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)纖連蛋白與3T3細胞的整合素結(jié)合可以引發(fā)MAPK持久性激活。

本研究結(jié)果表明MAPK在Aβ42誘導的神經(jīng)細胞死亡過程中發(fā)揮用。實驗中所采用的MAPK抑制劑-鋸鱗血抑肽是通過抑制整合素的活化從而抑制MAPK信號通路的活化。這表明整合素蛋白在Aβ42介導的MAPK信號通路活化的過程中發(fā)揮作用。為了進一步確定發(fā)揮作用的整合素蛋白，分別采用α1整合素抑制劑，β1整合素的抑制，α1+β1整合素抑制劑，Aβ42纖維分別作用細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α1整合素抑制劑和α1+β1整合素抑制劑可以有效降低Aβ42纖維所誘導產(chǎn)生的細胞死亡，但是單獨用β1整合素抑制劑作用細胞將不會有效降低細胞的死亡率。通過進一步檢測不同實驗條件下MAPK通路的活化程度，發(fā)現(xiàn)當用α1、β1、α1+β1整合素抑制劑分別作用細胞時，細胞中p-ERK/ERK蛋白比值明顯降低，這說明細胞中MAPK信號通路的激活被抑制。如果在加入α1、α1+β1整合素抑制劑后，用Aβ42纖維聚集體作用細胞，細胞中p-ERK/ERK蛋白比值也發(fā)生明顯降低。其中以α1+β1整合素抑制劑為胞外基質(zhì)與以α1+β1整合素抑制劑和Aβ42纖維聚集體為胞外基質(zhì)時，細胞中p-ERK/ERK蛋白比值最低。這說明α1整合素和α1+β1整合素復合體對MAPK信號通路的激活具有十分重要的作用。而如果先后以β1整合素抑制劑和Aβ42纖維聚集體作用細胞，細胞中p-ERK/ERK蛋白比值與對照組相比變化不大。這說明單獨的β1整合素對Aβ42纖維誘導MAPK信號通路激活導致細胞死亡的過程中沒有發(fā)揮顯著作用。

對于Aβ激活α1整合素的分子機制至今仍然不清楚。其中一個可能的機制是Aβ直接與整合素相結(jié)合。這種結(jié)合可能是由Aβ的5～8個氨基酸所介導的。 這個序列包含了一個潛在的整合素結(jié)合位點(RHDS)〔10〕。另一種方式可能是Aβ可以間接結(jié)合到整合素上。整合素可能是Aβ纖維與細胞表面受體分子作用的一部分〔11〕。最近在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中得到了這種機制的證據(jù)。Aβ纖維黏附到神經(jīng)膠質(zhì)細胞是由CD36，CD37和α6整合素異二聚體形成的復合物所介導的〔12〕。但是對于這種Aβ接受子復合物的了解不是很充分，不過最近有研究表明NMDA接受子也和整合素一樣在Aβ介導的神經(jīng)毒性中有著重要的作用。

Zhang等〔13〕發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)的神經(jīng)元暴露在Aβ(1～42)和Aβ(25～35)的條件下，F(xiàn)AK的磷酸化水平上升。但是根據(jù)本研究結(jié)果，與Aβ共同孵育的SH-SY5Y細胞中磷酸化的FAK水平并沒有升高。這可能是由于所采用的細胞系不同，導致實驗結(jié)果出現(xiàn)不同。但是對于FAK的具體變化我們?nèi)匀恍枰嗟膶嶒炞C據(jù)。

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〔2017-02-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

R74

A

1005-9202(2017)18-4486-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.024

齊平建(1971-)，男，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科研究。

王華民(1983-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科研究。