王春利，趙曉娟，王英姿

（1.江門出入境檢驗檢疫局，廣東江門 529000； 2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東廣州510225）

白酒中8種生物胺的高效液相色譜分析法

王春利1，趙曉娟2，王英姿1

（1.江門出入境檢驗檢疫局，廣東江門 529000； 2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東廣州510225）

建立了白酒中8種生物胺殘留的高效液相色譜分析方法，樣品采用正丁醇-三氯甲烷萃取，丹磺酰氯衍生。實驗結(jié)果表明，該方法在1～50 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2≥0.996；在1～10 mg/L添加水平范圍內(nèi)，平均加標回收率在82.22%～94.11%之間，相對標準偏差RSD＜10%；LOD在0.01～0.10 mg/L之間，LOQ在0.03～0.30 mg/L之間，該方法可用于白酒中生物胺的檢測。

白酒； 生物胺； 高效液相色譜法； 含量調(diào)查

生物胺(biogenic amine，BA)是一類低分子質(zhì)量的堿性多胺，具有生物活性，普遍存在于生物體的細胞中，是細胞內(nèi)的正?；钚猿煞?。微量的生物胺對人體有益，可以促進人體的生長發(fā)育和新陳代謝，提高腸道系統(tǒng)的免疫能力[1]。但是，當人體吸收過量的生物胺后，會出現(xiàn)頭痛、血壓變化、心悸等嚴重后果[2]。此外，生物胺還是生成致癌物質(zhì)亞硝胺的前體物質(zhì)，如腐胺和尸胺，不僅能增強組胺的毒性，而且還能與亞硝酸鹽反應(yīng)生成亞硝基胺[3-4]，嚴重威脅人體健康和生命安全。

生物胺是由游離氨基酸在微生物產(chǎn)生的脫羧酶作用下而生成，也可以是醛被胺化作用后產(chǎn)生，食品在發(fā)酵或腐爛過程中會產(chǎn)生生物胺[5]。生物胺廣泛存在于發(fā)酵乳制品[6]、酒類[7-8]、水產(chǎn)品[9]、肉類產(chǎn)品[10]、調(diào)味液[11-12]等富含蛋白質(zhì)和氨基酸的食品中。用于食品中生物胺測定的方法主要有電化學(xué)法[13]、色譜法[14-17]、酶聯(lián)免疫法[18]等。目前，酒中生物胺的研究多集中于葡萄酒、啤酒、桑果酒及黃酒，而白酒中生物胺檢測方法、生物胺種類和含量的研究報道比較少見。本研究建立的方法簡便、快捷、準確，可以用于白酒中8種生物胺的同時測定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

標準溶液配制：準確稱取適量色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺和亞精胺標準品于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，混勻，配制成濃度為1000 mg/L的標準儲備液，0～4℃保存。根據(jù)需要將標準儲備液稀釋成相應(yīng)濃度的標準溶液。

試劑及耗材：正己烷、甲醇和丙酮（均為色譜純），德國Merk公司；乙醚、正丁醇、三氯甲烷、谷氨酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純），廣州試劑廠；色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、精胺和亞精胺，美國Sigma公司；酪胺，德國Dr公司；丹磺酰氯（純度均大于98%）、組胺（純度＞96%），F(xiàn)LUKA公司。

儀器設(shè)備：HPLC Waters e2695配Waters e2489紫外檢測器，美國Waters公司；3K15冷凍離心機，德國Sigma公司；VORTEX-2旋渦混合器，美國GENE公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，中國晶波；Turbovap lv濃縮氮吹儀，美國caliper公司；TP-214型分析天平，美國DENVER；Orion 868酸度計，美國Orion公司；Milli-Q超純水器，美國Millipore公司；0.22 μm濾膜針頭濾器，上海安譜。Thermo移液槍（200～1000 μL），美國Thermo Fisher公司。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Venusil XBP C18柱（250 mm ×4.6 mm，內(nèi)徑3 μm）；檢測器波長254 nm，進樣量20 μL，柱溫30℃，流動相A為甲醇，B為超純水，流速1.5 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3 樣品的萃取和衍生

量取20.00 mL水樣，濾紙過濾，濾液加氯化鈉至飽和（若水樣中含有油脂則加入10 mL正己烷，混勻，棄去上層有機相）。量取5 mL濾液于15 mL離心管中，用0.1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到12.0，加入5.0 mL正丁醇和三氯甲烷（1∶1，V/V）混合溶液，漩渦振蕩2 min后以5000 r/min離心5 min，保留上層有機相，重復(fù)上述萃取2次，合并萃取液。量取3.0 mL萃取液并加入濃度1 mol/L鹽酸0.2 mL，60℃氮吹近干，用0.1 mol/L的鹽酸定容至1 mL，待衍生。

精確量取1.0 mL待衍生的試樣溶液后，加入1.5 mL飽和碳酸氫鈉溶液和1.0 mL丹磺酰氯衍生溶液（10 mg/L丙酮溶液），充分混勻。在60℃水浴條件下反應(yīng)30 min，再加入谷氨酸鈉溶液100 μL，充分混勻，60℃保溫15 min。取出，加入超純水l mL，40℃氮吹除去丙酮，之后加入乙醚3 mL，漩渦振蕩1 min，靜置分層后，吸取乙醚層，重復(fù)操作2次，合并乙醚提取液，40℃條件下氮氣吹至近干，加入1.0 mL乙腈，溶液用0.22 μm濾膜過濾，濾液待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系和檢出限

按照1.1中的方法配制8種生物胺的混合標準溶液進行線性實驗，標準質(zhì)量濃度為1.0 mg/L、2.50mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、15.0mg/L、25.0mg/L、50.0 mg/L。按照1.3中的方法進行衍生，通過HPLC進行測定。以3倍信噪比作為檢出限的確定標準，以10倍信噪比作為定量限的確定標準。生物胺分離的液相色譜圖見圖1，回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。

圖1 5種生物胺混合標準溶液的液相色譜圖 (5.0 mg/L)

由圖1可知，8種生物胺色譜峰無重疊，分離較好。由表2可知，8種生物胺在1.0～50.0 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.996。各組分生物胺的檢出限(LOD)為0.01～0.10 mg/L，定量檢出限(LOQ)為0.03～0.30 mg/L，滿足生物胺檢測的要求。

表2 8種生物胺標準的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

2.2 重復(fù)性的測定

對8種生物胺混標進行重復(fù)測定(n=5),結(jié)果見表3。結(jié)果顯示相對標準偏差RSD≤5.02%，表明重復(fù)性較好。

表3 生物胺的重復(fù)性實驗 (mg/L)

2.3 加標回收率的測定

選取空白樣品做1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L 3個濃度的加標回收率實驗，應(yīng)用上述方法進行前處理并測定，各加標水平樣品平行測定3次，結(jié)果見表4。

由表4可知，5種生物胺在1.0～10.0 mg/L添加水平范圍內(nèi)，平均回收率在82.22%～94.11%之間，相對標準偏差RSD在2.36%～7.96%之間，均符合檢測要求。

2.4 白酒樣品分析

表4 生物胺加標回收率的測定

表5 白酒樣品中生物胺的測定 (mg/L)

在當?shù)爻须S機購買5種醬香型白酒，按照本研究方法進行生物胺檢測，檢測結(jié)果見表5。

由表5可知，5種白酒中均有色胺和酪胺，β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、精胺和亞精胺均未檢出。其中色胺含量在8.7～13.0 mg/L，酪胺含量在0.016～0.027 mg/L，酪胺含量明顯小于色胺，色胺為5種白酒中的主要生物胺。

3 結(jié)論

目前，國內(nèi)外關(guān)于酒中生物胺的研究多集中于啤酒、黃酒和紅酒，對于白酒中生物胺的檢測方法和生物胺分布情況研究較少。本研究所建立的方法，操作簡便，靈敏度高，可用于白酒中色胺、腐胺、β-苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺的快速檢測，這對于提高白酒產(chǎn)品質(zhì)量，保障食品安全，幫助政府部門加強酒類市場監(jiān)管具有重要意義。此外，與歐盟、美國相比，我國在酒中生物胺限量標準制定方面存在較大差距，本文也為相關(guān)標準的制訂和完善提供參考。

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Determination of 8 Biogenic Amines in Baijiu by HPLC

WANG Chunli1,ZHAO Xiaojuan2and WANG Yingzi1
(1.Jiangmen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Jiangmen,Guangdong 529000;2.Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou,Guangdong 510255,China)

A method for the determination of 8 biogenic amines in Baijiu by high-performance liquid chromatography(HPLC)had been developed.Baijiu samples were extracted with N-butanol and chloroform,and derived by sulfonyl chloride.The experimental results showed that,the proposed method had a good correlation within the range of 1～50 mg/L,and the correlation coefficient was above 0.996,the average recovery was 84.75%to 95.20%in 1～10 mg/L addition level range,RSD(n=3)was less than 10%,LOD was between 0.01～0.10 mg/L,and LOQ ranged within 0.03～0.30 mg/L.This method could be used for the detection of biogenic amines in Baijiu.

Baijiu;biogenic amines;HPLC;content measurement

TS262.3；TS261.4；TS261.7

A

1001-9286（2017）11-0113-04

10.13746/j.njkj.2017171

2016年廣東省科技發(fā)展專項資金（協(xié)同創(chuàng)新與平臺環(huán)境建設(shè)方向）項目；江門市科技項目（江科[2016]191號）。

2017-06-13

王春利 (1980-)，男，高級工程師，碩士，E-mail：344159092@qq.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-08-17；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170817.1439.013.html。