王美玲, 耿麗麗, 段江燕, 張 杰*

(1. 山西師范大學生命科學學院, 臨汾 041004; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

拮抗核盤菌Bt菌株的篩選及抑菌活性研究

王美玲1,2, 耿麗麗2, 段江燕1*, 張 杰2*

(1. 山西師范大學生命科學學院, 臨汾 041004; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

利用平板對峙試驗從170株Bt菌株中篩選獲得12株對核盤菌Sclerotiniasclerotiorum有抑菌活性的菌株,對其中4株活性較強的菌株進行抗病相關(guān)基因分析,發(fā)現(xiàn)菌株中都含有幾丁質(zhì)酶基因,測定4AP1菌株發(fā)酵液的幾丁質(zhì)酶活力為672.4 U/mL。通過對4AP1菌株pH和溫度敏感性的研究發(fā)現(xiàn),4AP1菌株最高可耐受55℃高溫及pH 12緩沖液的處理,抑菌活性與對照無顯著差異。且該菌株抑菌譜較廣,除核盤菌外,對小麥赤霉病菌Fusariumgraminearum等其他9種病原真菌均有抑制作用。本研究獲得的4AP1菌株對核盤菌具有較強抑制作用,且耐熱耐強堿環(huán)境,為構(gòu)建殺蟲抗病Bt工程菌提供了菌株資源。

核盤菌; Bt菌株; 抑菌活性; 幾丁質(zhì)酶

油菜菌核病是由核盤菌引發(fā)的一種真菌病害,在全世界近100多個國家造成不同程度的危害[1]。核盤菌的寄主范圍極其廣泛,可寄生的植物多達75個科278個屬408個種以及42個變種或亞種[2]。目前對核盤菌比較有效的防治方法是化學防治,但每年我國化學農(nóng)藥的使用量高達50多萬t,對環(huán)境已造成嚴重的破壞,國際上部分國家已經(jīng)限制使用化學殺菌劑[3-4]。而生物防治因其對環(huán)境友好且不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點具有很好的開發(fā)前景。目前生物防治菌核病主要是應(yīng)用木霉和芽胞桿菌等[5-8],芽胞桿菌因其易于分離以及產(chǎn)生的芽胞抗逆性強等優(yōu)點,在病害防治中占有重要的地位。

蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis,簡稱Bt,可產(chǎn)生多種殺蟲晶體蛋白,對昆蟲有很強的毒性作用,是一種應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲劑[9-13]。Takahashi和Hyakumachi等研究發(fā)現(xiàn),Btfukuokaensis亞種B88-82菌株和sotto亞種RG1-6菌株可以誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性,通過增強植物自身免疫力而提高抗病性[14-15]。Bt菌株可以分泌一些抗病抑菌活性物質(zhì),祁紅兵等從80株Bt菌株中篩選到兩株Bt菌株QB51和HD7,這2株菌株均具有較高的幾丁質(zhì)酶活力[16];盧偉等篩選到19株Bt菌株,其分泌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對小麥赤霉病菌FusariumgraminearumSchwabe有抑菌活性[17]。許多細菌、病毒等都能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶(chinitase,EC 3.2.1.14)。微生物所產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶與其他來源的幾丁質(zhì)酶一樣分為外切幾丁質(zhì)酶和內(nèi)切幾丁質(zhì)酶,而絕大多數(shù)微生物產(chǎn)生的是內(nèi)切幾丁質(zhì)酶,能特異性地將幾丁質(zhì)中的β-1,4-糖苷鍵水解成N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine,NAG)[18]。微生物幾丁質(zhì)酶活性的最適pH一般在3～10之間,而發(fā)揮抑菌活性的最適溫度多在50～60℃,高于60℃酶容易失活[19]。

目前報道,解淀粉芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌以及枯草芽胞桿菌等可以用于防治油菜菌核病[6, 20-21],而關(guān)于Bt的報道主要集中在其殺蟲活性方面[22]。本研究從Bt標準菌株庫中分離獲得對核盤菌有較高抑菌活性的4AP1菌株,并對其抑菌譜、抑菌活性的穩(wěn)定性及其中幾丁質(zhì)酶的活性進行研究。旨在獲得對核盤菌有較高防效的Bt菌株,以期為真菌病害的防治提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

病原真菌:10種供試病原真菌，核盤菌Sclerotiniasclerotiorum、小麥赤霉病菌Fusariumgraminearum、黃瓜炭疽病菌Colletotrichumorbiculare、蘋果輪紋病菌Botryosphaeriaberengerianaf.sp.piricola、水稻稻瘟病菌Magnaporthegrisea、黃瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum、黃瓜黑星病菌Cladosporiumcucumerinum、水稻紋枯病菌Thanatephoruscucumeris、棉花黃萎病菌Verticilliumdahliae、蘋果腐爛病菌Cytosporamandshurica由武漢科諾公司提供。

Bt菌株:供試菌株共170株,其中165株來自中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所的標準Bt菌株庫;另外5株Bt185、G03、HD73、HD73-和HBF-18由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所抗蟲生物技術(shù)課題組保存。

供試植物:甘藍型油菜Brassicanapus(L.),品種為‘新四月蔓’,栽培用土為營養(yǎng)土∶蛭石=2∶1;光照時間14 h(7 000 lx),黑暗時間10 h,種植時間約30 d;種植地點為中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所溫室。

培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10.0 g/L,酵母提取物5.0 g/L,NaCl 10.0 g/L,121℃滅菌20 min),LB固體培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基加瓊脂15 g/L),5%的膠體幾丁質(zhì)和PDA固體培養(yǎng)基,購自北京冰達生物科技有限公司。

引物由Sangon Biotech北京合成部合成,測序由中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學工程開放實驗室完成,生化及分子生物學試劑均為市售分析純。

1.2 對核盤菌具有抑菌活性Bt菌株的篩選

將純化后的Bt菌株分別接種在LB液體培養(yǎng)基中,30℃,220 r/min活化12 h。核盤菌在固體PDA平板上活化生長至滿板時,利用打孔器取直徑為7 mm的圓形菌餅倒置于90 mm PDA固體培養(yǎng)基平板的中央位置,然后在平板對稱位置距離菌餅20 mm處放置4個直徑為6 mm的圓形無菌濾紙片,每個濾紙片滴加5 μL待測菌液,隨后將平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察有無抑菌圈產(chǎn)生,每個處理3個重復。

1.3 菌株中抑菌基因的檢測

提取菌株的基因組,方法參照《分子克隆指南》[23]。利用Raddadi等[24]報道的引物(表1)擴增以下5個基因：降解真菌細胞壁幾丁質(zhì)的幾丁質(zhì)酶基因和幾丁質(zhì)外切酶基因、ZwA抗生素基因簇的丙二酸單酰輔酶A轉(zhuǎn)?；富蚝蚙wA抗性基因、干擾細菌病原菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶基因。PCR擴增反應(yīng)體系(20 μL):2×TaqMix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,濃度為10 μmol/L,模板DNA 1 μL,超純水8.2 μL。PCR擴增反應(yīng)條件:94℃預變性10 min;94℃變性1 min,合適的溫度退火1 min,72℃延伸一定的時間(1 kb的擴增產(chǎn)物延伸時間為1 min),30個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠、140 V電泳檢測,產(chǎn)物送交測序。將測序獲得的核酸序列,上傳NCBI數(shù)據(jù)庫進行BlastN比對分析。

表1PCR引物的核酸序列和退火溫度

Table1NucleotidesequencesandannealingtemperaturesofPCRprimers

基因名稱Genesname引物名稱和序列(5′→3′)Primernameandsequence(5′→3′)退火溫度/℃Annealingtemperature幾丁質(zhì)酶基因ChitChitF：ATTCACACTGCTATTACTATCChitR：TGACGGCATTTAAAAGTTCGGC50胞外幾丁質(zhì)酶基因Chit36Chi36F：GATGTTAAACAGGTTCAAChi36R：TTATTTTTGCAAGGAAAG50丙二酸單酰輔酶A轉(zhuǎn)?；富騇AT(orf2)F：ATTGTATTTATGTTTCCTGGCGTAR：TTTGTTCTCTCTCTTTAATCTGTT55ZwA抗性基因zmaRA0678：ATGTGCACTTGTATGGGCAGA0677：TAAAGCTCGTCCCTCTTCAG55酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶基因aiiAAIF：TAAATGTAAAGGTGGATACATAATGACAGTAIR：AGCTCATGACTTTTTGCACTATATATA50

1.4 幾丁質(zhì)酶活力的測定

1.5 不同pH緩沖液及溫度對4AP1菌株抑菌能力的影響

將菌株接種在5 mL LB液體培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)12 h,收集菌液,分別取300 μL菌液于10個1.5 mL離心管中,其中4管分別加入等量的pH分別為10、11、12和13的緩沖液,顛倒混勻,室溫反應(yīng)30 min。5管分別置于溫度為55、60、65、70和80℃的恒溫水浴鍋中溫育30 min,剩余1管不做任何處理。分別取5 μL反應(yīng)液通過平板對峙試驗檢測其對核盤菌的抑菌能力,并測量其抑菌圈直徑,每個處理設(shè)3個重復。

1.6 抑菌譜的檢測

利用對核盤菌抑菌能力最強的菌株,通過平板對峙試驗檢測其對10種病原真菌的抑菌能力,每個處理設(shè)3個重復,并測量抑菌圈直徑,培養(yǎng)溫度均為28℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗核盤菌Bt菌株的篩選

通過平板對峙試驗檢測170株Bt菌株對核盤菌的抑菌能力,結(jié)果顯示來自標準菌株庫的12株Bt菌株4AP1、4R1、4BR1、4BS1、4AA1、4J5、4K5、4L1、4D12、4D16、4G7和4B3對核盤菌有抑菌活性,比例為7.1%。其中4AP1、4BR1、4BS1、4AA1菌株抑菌能力較強(圖1),而實驗室常用菌株Bt185、G03、HD73、HD73-和HBF-18均對核盤菌無抑菌活性。

圖1 Bt菌株抑菌能力檢測Fig.1 Analysis of antifungal activity of Bt strains

2.2 Bt菌株中抑菌相關(guān)基因檢測及幾丁質(zhì)酶活力的測定

提取4AP1、4BR1、4BS1、4AA1菌株的基因組,對4個真菌病害抗性相關(guān)基因:幾丁質(zhì)酶基因、幾丁質(zhì)外切酶基因、丙二酸單酰輔酶A轉(zhuǎn)?；富蚝蚙wA抗性基因，以及1個細菌病害抗性相關(guān)基因:酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶基因進行PCR鑒定。鑒定結(jié)果顯示,4個菌株中均檢測到幾丁質(zhì)酶基因和酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶基因(表2);4AP1菌株含有4個抗病相關(guān)基因,包括幾丁質(zhì)酶基因、丙二酸單酰輔酶A轉(zhuǎn)?；富?、ZwA抗性基因和酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶基因(圖2)。對4AP1菌株的幾丁質(zhì)酶基因進行PCR擴增并測序,NCBI BlastN結(jié)果顯示4AP1菌株中幾丁質(zhì)酶基因(1 873 bp)與BtHD201幾丁質(zhì)酶基因(GenBank登錄號:AY452506.1)核酸序列相似性為99%。隨后對4AP1菌株發(fā)酵液的幾丁質(zhì)酶活力進行測定,結(jié)果顯示其酶活力為672.4 U/mL。

表24AP1、4BR1、4BS1、4AA1菌株抗病相關(guān)基因鑒定結(jié)果1)

Table2Identificationofdiseaseresistance-relatedgenesof4AP1,4BR1,4BS1and4AA1strains

基因Gene4AP14BR14BS14AA1幾丁質(zhì)酶基因Chit++++幾丁質(zhì)外切酶基因Chit36-+++丙二酸單酰輔酶A轉(zhuǎn)?；富騇AT(orf2)+---ZwA抗性基因zmaR+---?；呓z氨酸內(nèi)酯酶基因aiiA++++

1) “+”表示鑒定到該基因;“-”表示未鑒定到該基因。

“+” represents identified gene; “-”represents unidentified gene.

圖2 4AP1菌株抗病相關(guān)基因鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of disease resistance-related genes of 4AP1 strains

2.3 pH及溫度對4AP1菌株抑菌能力的影響

選擇抑菌能力最強的4AP1菌株,分析pH及溫度對Bt菌株抑菌能力的影響。室溫條件下,經(jīng)pH分別為10、11、12的緩沖液處理30 min后,4AP1菌株抑菌活性與對照無顯著差異,抑菌圈直徑在30.3～32.8 mm之間,而經(jīng)pH為13的緩沖液處理后,其抑菌活性顯著降低,抑菌圈直徑為(25.0±0.9)mm(圖3a),說明在pH 10～12緩沖液中4AP1菌株能保持穩(wěn)定的抑菌活性。

不同溫度處理對4AP1菌株活性影響測定結(jié)果表明:經(jīng)55℃處理30 min后4AP1菌株可保持穩(wěn)定的抑菌活性,抑菌圈直徑為(29.2±0.8)mm;隨著處理溫度升高其抑菌活性均顯著降低,80℃高溫處理后其抑菌活性完全喪失(圖3b)。表明4AP1菌株僅耐55℃高溫處理。

圖3 pH及溫度對4AP1菌株抑菌能力的影響Fig.3 Effects of pH and temperature on antagonistic ability of 4AP1 strains

2.4 4AP1菌株抑菌譜的測定

利用平板對峙試驗對4AP1菌株的抑菌譜進行測定,結(jié)果顯示:4AP1菌株對核盤菌S.sclerotiorum、小麥赤霉病菌F.graminearum、黃瓜炭疽病菌C.orbiculare、蘋果輪紋病菌B.berengerianaf.sp.piricola、水稻稻瘟病菌M.grisea、黃瓜枯萎病菌F.oxysporum和黃瓜黑星病菌C.cucumerinum的抑菌能力最強,抑菌圈直徑均>30 mm;對水稻紋枯病菌T.cucumeris和棉花黃萎病菌V.dahliae的抑菌效果較強,抑菌圈直徑介于20～30 mm之間;對蘋果腐爛病菌C.mandshurica的抑菌效果較弱,抑菌圈直徑<20 mm,具有較廣的抑菌譜(表2)。

3 討論

長期以來,人們對于Bt的研究主要集中于對其殺蟲活性的研究[11, 22],也有研究報道Bt可以抑制病原真菌的生長。韓苗苗等研究發(fā)現(xiàn)Bt519-1對小麥赤霉病菌F.graminearum等8種病原真菌有不同的抑制作用[26];周國旺等研究發(fā)現(xiàn)BtLTS290菌株可抑制6種馬鈴薯致病鐮孢菌的生長[27]。本研究從165株標準Bt菌株和5株實驗室常用菌株中篩選到4株對核盤菌抑菌活性較強的Bt菌株,發(fā)現(xiàn)其中的4AP1菌株對其他9種病原真菌均有不同程度的抑制作用,尤其對病害嚴重的水稻稻瘟病菌M.grisea以及小麥赤霉病菌F.graminearum等具有較強的抑制效果。此外,PCR鑒定結(jié)果顯示4株抑菌活性較強的Bt菌株中都含有幾丁質(zhì)酶基因,且4AP1菌株發(fā)酵液具有較高的幾丁質(zhì)酶活力,因此推測該菌株的抑菌活性可能與其含有的幾丁質(zhì)酶相關(guān),或者與Bt菌株分泌的環(huán)脂肽類抗生素相關(guān)[28],需要進一步的試驗驗證。

表24AP1菌株抑菌能力測試1)

Table2Antagonisticabilityassayof4AP1strains

病原真菌Pathogenfungus4AP1菌株抑菌能力Antagonisticabilityof4AP1核盤菌Sclerotiniasclerotiorum+++小麥赤霉病菌Fusariumgraminearum+++黃瓜炭疽病菌Colletotrichumorbiculare+++蘋果輪紋病菌Botryosphaeriaberengerianaf．sp．piricola+++水稻稻瘟病菌Magnaporthegrisea+++黃瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum+++黃瓜黑星病菌Cladosporiumcucumerinum+++水稻紋枯病Thanatephoruscucumeris++棉花黃萎病Verticilliumdahliae++蘋果腐爛病Cytosporamandshurica+

1) “+”表示抑菌圈直徑≤20 mm,“++”表示20 mm<抑菌圈直徑<30 mm,“+++”表示抑菌圈直徑≥30 mm。

+ represents diameter of inhibition zone≤20 mm; ++ represents 20 mm< diameter of inhibition zones<30 mm; +++ represents diameter of inhibition zone≥30 mm.

已有的研究表明,微生物幾丁質(zhì)酶在pH 3～10之間、低于60℃的條件下可以保持降解幾丁質(zhì)的活性[19]。陶樹興等研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌2-3-2分泌幾丁質(zhì)酶的最適溫度為40℃,最適pH為7.0,溫度高于50℃及堿性條件下酶活力都會下降[29]。黃小紅等研究發(fā)現(xiàn)Bt-WB7分泌的幾丁質(zhì)酶活性在pH 4.5～6.5區(qū)域穩(wěn)定,而在pH>8時酶很快失活,且55℃處理30 min后,酶的活性沒有發(fā)生變化,高于該溫度,酶就失去活性[30]。本研究發(fā)現(xiàn)的4AP1菌株55℃處理30 min后活性無顯著變化,隨著溫度的升高,活性降低,80℃處理后活性完全喪失;經(jīng)pH 10～13緩沖液處理30 min后仍有較高的抑菌活性,但其發(fā)酵液上清沒有抑菌活性,該幾丁質(zhì)酶可能存在于菌體內(nèi),需要后續(xù)純化分離,進一步確定其對堿性條件的耐受能力。

通過本研究發(fā)現(xiàn)Bt菌株中部分菌株對核盤菌等病原真菌有較強抑菌能力,其中4AP1菌株抑菌物質(zhì)具有耐堿和耐熱性,為真菌病害生防菌的篩選提供了新的思路,為構(gòu)建殺蟲抗病Bt工程菌奠定了基礎(chǔ),對于增加Bt制劑的市場份額具有重要的意義。

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(責任編輯： 田 喆)

ScreeningofandstudyingonBtstrainswithantagonisticactivityagainstSclerotiniasclerotiorum

Wang Meiling1,2, Geng Lili2, Duan Jiangyan1, Zhang Jie2

(1.CollegeofLifeSciences,ShanxiNormalUniversity,Linfen041004,China; 2.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

A total of 12 Bt strains with antifungal activity againstSclerotiniasclerotiorumwere obtained from 170 strains of Bt strains by the plate confrontation test. Disease resistance-related genes of 4 strains with higher activity were analyzed and all these strains containedchitgene. Chitinase activity of 4AP1 strain cell culture was 672.4 U/mL. The 4AP1 strain could withstand high temperature of 55℃ and pH 12, and its antifungal activity was not significantly different from the control. Moreover, the antimicrobial spectrum of 4AP1 strain was broad, except forS.sclerotiorum, which had antifungal activity against the other 9 fungal diseases such asFusariumgraminearum, etc. In this study, 4AP1 strains with strong antifungal activity againstS.sclerotiorum, and heat and alkali resistance were obtained, and this provides strain resources for construction of engineering Bt with insecticidal activity and disease-resistance.

Sclerotiniasclerotiorum; Bt strain; antagonistic activity; chitinase

2017-02-08

2017-03-31

國家重點研發(fā)計劃(2017YFD0201204)

* 通信作者 E-mail: duanjiangyan123@163.com; jzhang@ippcaas.cn

S 476

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.009