QuEChERS—液相色譜—離子阱—飛行時間質(zhì)譜法快速篩查玉米酒糟粕中的10種真菌毒素

張帆+王美玲+戴潔蕓+顏鴻飛+張瑩+戴華

摘要：建立了玉米酒糟粕中多種真菌毒素類物質(zhì)（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮）的離子阱-飛行時間質(zhì)譜檢測法。樣品經(jīng)乙腈超聲提取，提取液經(jīng)QuEChERS吸附劑凈化，以C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）分離，乙腈和0.1%乙酸為流動相梯度洗脫，正負模式同時掃描；以保留時間和化合物精確分子離子質(zhì)量對真菌毒素進行識別。結果表明，10種化合物在一定濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)大于0.98。定量限（S/N≥10）為3～20 μg/kg。3種水平的加標平均回收率為51.6%～111.3%，相對標準偏差（RSD）為4.1%～14.7%。該方法利用精確質(zhì)量數(shù)匹配和自建標準譜庫檢索，實現(xiàn)快速篩查，并使用多級特征碎片離子進行確證，具有簡便、快速、高效、準確等優(yōu)點，適用于玉米酒糟粕中多種真菌毒素類物質(zhì)的快速篩查和測定。

關鍵詞：高效液相色譜-離子阱-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜；玉米酒糟粕；真菌毒素；篩查

中圖分類號： O657.7+2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0202-04

玉米是干法生產(chǎn)燃料乙醇的主要原料，玉米酒糟是現(xiàn)代化燃料乙醇工廠干法生產(chǎn)燃料乙醇過程中，用玉米籽實與精選酵母混合發(fā)酵生產(chǎn)乙醇和二氧化碳后，剩余的發(fā)酵殘留物通過低溫干燥形成的共生產(chǎn)品。在燃料乙醇生產(chǎn)中，淀粉發(fā)酵得到乙醇，但玉米顆粒中的剩余部分（胚乳、胚芽）仍保留著包括能量、蛋白和磷在內(nèi)的許多初始營養(yǎng)價值，可回收并重新組合成各種動物飼料組分。我國已成為全球最大的玉米酒糟蛋白飼料進口國。然而營養(yǎng)變異和真菌毒素污染是玉米和玉米酒糟面臨的主要問題，給食品工業(yè)、飼料工業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了一系列不容忽視的問題。

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，常見真菌毒素有黃曲霉毒素、鐮刀菌毒素、玉米赤霉烯酮類、伏馬菌素等。黃曲霉素是一類毒性極強的物質(zhì)，具有強致癌性和強免疫抑制性，天然污染的黃曲霉毒素主要有黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2，其中花生、玉米污染最為嚴重。玉米赤霉烯酮（ZEN）是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種類雌激素真菌毒素，廣泛存在于霉變的玉米、高粱、小麥、大麥等糧食作物中，能刺激雌激素受體轉(zhuǎn)錄，降低家畜的耗料量，導致其生長下降，也是玉米酒糟質(zhì)量安全的主要問題，主要包括α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮等[1]。為了保護人們身體健康，很多國家包括中國制定了糧谷和飼料中一部分真菌毒素的限量。歐盟已經(jīng)規(guī)定了所有飼料原料、飼料、飼料添加劑、輔助性飼料里面的黃曲霉毒素含量不能超過20 μg/kg。我國GB 13078—2001《飼料衛(wèi)生標準》規(guī)定，玉米花生餅（粕）中黃曲霉毒素B1限量為50 μg/kg。

目前對于糧谷和飼料中真菌毒素的檢測方法主要有免疫法、薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）及高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）等[2-6]。然而離子阱飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS-IT-TOF）兼具離子阱和高分辨飛行時間質(zhì)譜的檢測能力，能夠進行分子量的精確測定，同時還能提供多級質(zhì)譜碎片離子信息，使被測化合物的篩查和確證更加簡便化。真菌毒素的樣品前處理技術包括液-液萃取和固相萃取，最常用的小柱是免疫親和柱[7]和Mycosep 226萃取柱[8-9]。這些小柱雖然操作方便快捷，但是價格昂貴，增加了分析成本。分散固相萃取樣品前處理方法（QuEChERS）是近幾年發(fā)展起來的樣品前處理方法，由于前處理簡單、快速、高效，適用于各種分子結構和極性化合物的提取凈化，廣泛應用于水果、蔬菜中多種農(nóng)藥殘留的檢測。但這種方法在真菌毒素分析中使用很少。本研究基于QuEChERS原理的快速提取方法，結合離子阱-飛行時間質(zhì)譜技術，免去繁瑣的SPE凈化步驟，只需1步提取濃縮就可實現(xiàn)玉米酒糟粕中10種真菌毒素類物質(zhì)的快速篩查和定量測定，以期為玉米和玉米酒糟粕的進出口檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

液相色譜-離子阱-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（日本島津公司）；工作站LC MS solution V 3.6；SK-1渦旋混勻器（常州澳華儀器有限公司）；Sigma 2-16P高速離心機（德國Sigma公司）；Turbo Vap Ⅱ全自動氮吹濃縮儀（美國Capliper公司）。

黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉酮購于美國Sigma Aldrich公司和德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥95%。N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18-封端）和石墨化炭黑吸附劑（GCB）均為40～60 μm，購于北京艾杰爾有限公司。甲醇、乙腈為色譜純（德國Merck公司）。其余試劑均為分析純，試驗用水為超純水（美國Millipore超純水儀制備）。

1.2 標準溶液配制

分別稱取1 mg上述標準品，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容配制成100 μg/mL的標準儲備液，轉(zhuǎn)入棕色樣品瓶中，-18 ℃下避光保存。試驗時用甲醇稀釋上述標準儲備液，配制成不同濃度的混合標準使用液，4 ℃下保存。

試樣制備：取樣品約500 g，用粉碎機粉碎，裝入潔凈容器內(nèi)作為試樣，密封并標明標記，室溫下保存。

1.3 樣品前處理

稱取5 g均勻試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL水渦旋混勻并浸泡10 min，再加入2 g氯化鈉和15 mL 1%乙酸乙腈，渦旋混勻后，振蕩提取15 min，6 000 r/min 離心3 min；取上清液至另一刻度離心管中，再用10 mL 1%乙酸乙腈溶液重復上述提取操作，合并提取液并定容至25 mL。取10 mL提取液，加入2 g無水硫酸鎂、100 mg C18粉末和50 mg PSA粉末，渦旋混勻2 min，6 000 r/min離心3 min；取5 mL上清液，40 ℃下氮氣吹至近干，用2 mL甲醇-水混合溶液（等體積）溶解殘渣，過0.22 μm濾膜待測。endprint

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（4.6 mm×150 mm，3.5 m）。流動相A為0.1%乙酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序：0～5 min，90% A～60% A；5.1～13 min 60% B～30% B，保持2 min；15.1～18 min 30% B～90% B。柱溫為40 ℃。進樣體積為10 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：ESI，正負離子同時掃描；掃描范圍：MS1 m/z 200～400，MS2 m/z 50～400，MS3 m/z 50～400；加熱模塊溫度：200 ℃；CDL溫度：200 ℃；霧化氣流速：1.5 L/min；干燥氣體壓力：100 kPa；離子源電壓：正離子模式+4.5 kV，負離子模式-3.5 kV；檢測器電壓：1.6 kV；質(zhì)量數(shù)校準方法：自動調(diào)諧優(yōu)化電壓，外標法校準質(zhì)量數(shù)。數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)為LC MS solution V 3.6。

2 結果與分析

2.1 質(zhì)譜條件和色譜條件的優(yōu)化

黃曲霉毒素類物質(zhì)易在正離子模式下電離，形成[M+H]+準分子離子，玉米赤霉烯酮類物質(zhì)在正離子模式下形成[M-H]-準分子離子；因此充分利用離子阱飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜快速正負極轉(zhuǎn)換功能，對樣品同時進行正負離子模式掃描，實現(xiàn)1次進樣得到所有化合物的質(zhì)譜信息，節(jié)省分析時間。同時優(yōu)化質(zhì)譜的離子源溫度、干燥氣流、檢測器電壓，使所有目標化合物都有良好的響應信號。

流動相考察了水-甲醇、0.1%乙酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、5 mmol/L乙酸胺-乙腈、0.1%乙酸-乙腈等體系對色譜峰形以及質(zhì)譜強度的影響。比較發(fā)現(xiàn)，選擇0.1%乙酸-乙腈作為流動相，梯度洗脫時，各化合物的離子化效率高且分離效果好，10種真菌毒素類物質(zhì)的保留時間和多級質(zhì)譜碎片離子見表1。

2.2 提取方法優(yōu)化

真菌毒素類物質(zhì)多屬于弱極性或中等極性，易溶于甲醇、乙腈、丙酮、三氯甲烷等有機溶劑。文獻報道常用的提取溶劑有甲醇水溶液（80 ∶ 20，V ∶ V）或乙腈水溶液（86 ∶ 14，V ∶ V）。由于玉米酒糟粕屬于干性樣品，本研究中先加水將樣品充分浸泡，再用1%乙酸乙腈提取，以保證提取溶劑與樣品充分接觸，提高回收率。加入過量氯化鈉，具有鹽析作用，使乙腈與水分層，同時降低基質(zhì)中親水性成分的溶解度，減少雜質(zhì)干擾。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

文獻報道的真菌毒素類物質(zhì)基本上采用免疫親和柱和多功能凈化柱凈化，本研究則采用分散固相萃取進行凈化，對C18、PSA、GCB等填料的凈化效果進行比較。結果表明，石墨化炭吸附劑能有效去除基質(zhì)中色素的影響；PSA吸附劑能去除樣品基質(zhì)中的脂肪酸。C18吸附劑可以去除樣品中的油脂和其他非極性干擾物，對目標化合物的吸附量不大。通過優(yōu)化試驗，發(fā)現(xiàn)加入50 mg PSA和100 mg C18混合吸附劑的凈化效果較好，能滿足大部分化合物的回收率要求（圖1）。

2.4 基質(zhì)效應

本研究用離子抑制率，即基質(zhì)空白添加中監(jiān)控離子響應強度比標準溶液中相應監(jiān)控離子響應強度減少的百分比，來表述樣品基質(zhì)對監(jiān)控離子響應強度的抑制作用。試驗結果顯示，本試驗條件下黃曲霉毒素B1、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的基質(zhì)抑制效應較嚴重，抑制率為48.5%～739%，而其他物質(zhì)的基質(zhì)抑制效應較小，低于20%。嘗試改變流動相比例或梯度等方法來消除基體效應，結果發(fā)現(xiàn)還是無法避免共流出雜質(zhì)產(chǎn)生的嚴重基質(zhì)抑制效應。因此本研究采用空白基質(zhì)配標來消除基體效應。

2.5 定性篩查及確證

在本研究條件下，對實際樣品進行正負離子掃描，將所獲得的總離子流圖應用高精度的質(zhì)量提取，得到各化合物的分子特征離子提取色譜圖。圖2為空白玉米酒糟粕中添加10種真菌毒素類物質(zhì)的離子提取色譜圖，通過檢索精確質(zhì)量譜庫，得到每種化合物與精確質(zhì)量譜庫中化合物的匹配度，結果表明10種真菌毒素類的匹配度均較高。因此，根據(jù)保留時間、精確質(zhì)量即可對多種化合物進行定性篩查，篩查出的陽性樣品再經(jīng)二級譜圖掃描，通過二級特征碎片離子標準數(shù)據(jù)庫檢索進行確證。

2.6 方法的線性關系及定量限

采用空白基質(zhì)配制不同濃度的混合標準溶液進行測定，以各組分的峰面積對質(zhì)量濃度繪制標準曲線，求得線性回歸方程和線性相關系數(shù)（表2）。以10倍信噪比（S/N≥10）對應的空白樣品添加質(zhì)量濃度作為方法的定量限（LOQ），經(jīng)樣品添加試驗確定玉米酒糟粕中10種真菌毒素類的定量限為3.0～20 μg/kg。

2.7 回收率與精密度試驗

在空白玉米酒糟粕樣品中，添加低、中、高3種濃度水平的混合標準溶液進行添加回收試驗，平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差。結果表明，10種真菌毒素類化合物的平均回收率為51.6%～111.3%，相對標準偏差（RSD）為4.1%～14.7%（表2）。

2.8 實際樣品分析

應用本方法對124個玉米酒糟粕樣品進行真菌毒素的篩查與測定。結果發(fā)現(xiàn)，在玉米酒糟粕中玉米赤霉醇類毒素有相當水平的檢出，其中玉米赤霉烯酮檢出率最高，含量為 23～646 μg/kg，α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的含量分別為22～50、30～83 μg/kg。黃曲霉毒素的檢出率相對較低，黃曲霉毒素總量一般低于20 μg/kg。圖3、圖4分別為玉米赤霉烯酮陽性樣品的提取離子流圖和多級質(zhì)譜圖。

3 結論

建立了玉米酒糟粕樣品中10種真菌毒素類化合物的液相色譜-離子阱-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜篩查方法。樣品經(jīng)乙腈提取，QuEChERS技術凈化，通過離子阱-飛行時間質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)匹配和二級特征碎片離子標準譜庫檢索，可實現(xiàn)對不同真菌毒素類化合物的同時定性篩查和定量分析。該方法前處理過程簡便、靈敏度高、選擇性好，能滿足日常檢測要求，可為玉米酒糟粕中真菌毒素的檢測和監(jiān)控提供技術保障，對嚴格控制其產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。endprint

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