史 杰 王 芳

川楝素對TRAIL抗肝癌活性及其機制研究

史 杰1王 芳2

目的 觀察川楝素對腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）抗肝癌活性影響并研究其機制。方法 將HepG2人肝癌細胞分為對照組、川楝素組、TRAIL組、川楝素+TRAIL組及川楝素+TRAIL+DR5小干擾RNA（DR5 siRNA）組，CCK-8法檢測HepG2細胞活力，流式細胞術檢測HepG2細胞的凋亡和線粒體膜電位，Western blot實驗和流式細胞術檢測HepG2細胞表面DR5表達水平及Caspase-8、Caspase-3活化水平。結果 TRAIL+川楝素組HepG2相對細胞活力（0.42±0.04），顯著低于 TRAIL 單治療組（0.84±0.07，P＜0.05）和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA 組（0.76±0.06，P＜0.05）。TRAIL+川楝素組HepG2細胞凋亡率（32.7±2.4）%，顯著高于TRAIL單治療組[（9.3±0.9）%，P＜0.05]和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA組[（13.8±1.1）%，P＜0.05]。川楝素處理對HepG2細胞Bcl-2家族蛋白的表達無明顯影響，但能顯著提高HepG2細胞表面DR5表達水平。TRAIL+川楝素組 HepG2細胞的相對線粒體膜電位（0.26±0.02），顯著低于 TRAIL 單治療組（0.78±0.06，P＜0.05）和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA 組（0.68±0.05，P＜0.05）。TRAIL+川楝素組 HepG2細胞 Caspase-8表達水平（0.37±0.04），顯著高于 TRAIL 單治療組（0.11±0.04，P＜0.05）及川楝素+TRAIL+DR5 siRNA 組（0.14±0.02，P＜0.05）；TRAIL+川楝素組 HepG2 細胞 Caspase-3 表達水平（0.42±0.04），顯著高于TRAIL 單治療組（0.13±0.02，P＜0.05）及川楝素+TRAIL+DR5 siRNA 組（0.17±0.02，P＜0.05）。結論川楝素可上調肝癌細胞死亡受體5（DR5）表達，提高TRAIL抗腫瘤活性。

肝細胞肝癌；川楝素；DR5；TRAIL

肝癌是預后很差的惡性腫瘤，致死率非常高[1]。盡管手術治療是目前治療肝癌最為有效的手段，然而對于中晚期不能進行手術的患者，化療或免疫治療是不可替代的治療手段[2]。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）屬于腫瘤壞死因子超家族成員。研究[3]表明，TRAIL能誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡而對正常細胞的功能無明顯影響，因此TRAIL是一種非常有臨床應用前景的腫瘤治療藥物。然而某些類型的腫瘤細胞，如肝細胞肝癌細胞對TRAIL治療的敏感性較低[4]，因此輔以其它藥物提高肝癌細胞對TRAIL的敏感性是提高其療效的有效方法。本研究的目的在于探討川楝素對TRAIL抗肝癌活性的影響并研究其機制。

1 材料與方法

1.1 材 料 川楝素購于南京春秋生物工程有限公司。人重組TRAIL、細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）、和凋亡檢測試劑盒購于美國Sigma-Aldrich。DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco。死亡受體5（DR5）、活化半胱天冬酶-8（cleaved caspase-8）、活化半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）和β肌動蛋白（β-actin）抗體購于美國Cell Signaling。DR5-PE流式細胞抗體購于美國Ramp;D system。增強化學發(fā)光（ECL）試劑盒購于美國Pierce。DR5小干擾RNA（DR5 siRNA）購于上海吉瑪制藥技術有限公司。脂質體 2000（Lipofectamine2000）購于美國 Invitrogen。

1.2 細胞培養(yǎng) 人肝細胞肝癌細胞系HepG2購于中科院上海細胞庫。細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。細胞每2～3天傳代1次，傳代時，用胰酶消化液使細胞進入懸浮狀態(tài)并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，將細胞懸液按1:3稀釋后傳代。

1.3 DR5基因沉默 為了抑制HepG2細胞中DR5的表達，在HepG2細胞中用Lipofectamine2000對DR5 siRNA按試劑操作說明書步驟進行轉染。簡要步驟如下：將DR5 siRNA或對照siRNA（終濃度為50pmol/mL）用Lipofectamine2000進行包裹后將其加入到無血清培養(yǎng)基進行混合。將貼壁的HepG2細胞置于該無血清培養(yǎng)基孵育6h，之后棄去無血清培養(yǎng)基加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。收集細胞用于后續(xù)實驗。DR5 siRNA轉染后的HepG2細胞由于存在DR5干擾RNA，因此其DR5的表達受到明顯抑制。

1.4 相對細胞活力測定 將HepG2細胞按5×103/孔接種在96孔板中。實驗分為對照組、川楝素組、TRAIL組、川楝素+TRAIL組及川楝素+TRAIL+DR5siRNA組。對照組、川楝素組、TRAIL組和川楝素+TRAIL組所用細胞為轉染對照siRNA的HepG2細胞，川楝素+TRAIL+DR5 siRNA組所用細胞為轉染DR5 siRNA的HepG2細胞。對照組為細胞不加藥物處理48h；川楝素組為細胞加入50μmol/mL川楝素處理48h；TRAIL組為細胞加入2ng/mL TRAIL培養(yǎng)48h；川楝素+TRAIL組為細胞用2ng/mL TRAIL聯合50μmol/mL川楝素處理48h；川楝素+TRAIL+DR5 siRNA組為DR5 siRNA轉染的細胞用2ng/mL TRAIL聯合50μmol/mL川楝素處理48h。藥物處理完畢后加入20μL CCK-8試劑并在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，450nm波長下測定OD值。HepG2相對細胞活力用OD藥物處理組/OD對照組表示。

1.5 Western blot實驗 將 HepG2細胞按 1×106/孔接種在6孔板中，按上述進行分組。藥物處理完畢后用蛋白提取液提取HepG2細胞中的總蛋白質。將等量的總蛋白質用12.5%SDS-PAGE進行電泳分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到PVDF 膜上，用 Bcl-2、Bcl-xl、Bax、DR5、活化 Caspase-8、活化Caspase-3和β-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。蛋白灰度值分析用Image J軟件處理。目標蛋白的相對表達水平用它們的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示。

1.6 HepG2細胞表面DR5表達水平 將HepG2細胞按1×106/孔接種在6孔板中，分為對照組和川楝素組處理。收集細胞并將細胞用帶PE熒光標記的DR5抗體進行孵育，孵育完畢后用流式細胞儀檢測兩組細胞表面DR5的表達情況。

1.7 線粒體膜電位測定 將HepG2細胞按1×106/孔接種在6孔板中，按1.4所述進行分組。處理完畢后按試劑操作說明書步驟將細胞用JC-1染料進行孵育，孵育完畢后用流式細胞儀檢測JC-1發(fā)出的紅色熒光，紅色熒光強度越強，線粒體膜電位越高[5]。藥物處理組的相對線粒體膜電位為各處理組的JC-1熒光強度與對照組熒光強度的比值。

1.8 細胞凋亡實驗 將HepG2細胞按1×106/孔接種在6孔板中，按上述進行分組。藥物處理完畢后按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細胞中孵育20min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡，Annexin-V陽性細胞即為凋亡細胞。

2 結果

2.1 各組HepG2細胞活力和凋亡率比較 CCK-8細胞活力實驗結果顯示，TRAIL+川楝素組HepG2的相對細胞活力顯著低于TRAIL單處理組和川楝素單處理組（見表1）。流式細胞實驗結果顯示，TRAIL+川楝素組HepG2細胞凋亡率顯著高于TRAIL單處理組和川楝素單處理組，表明川楝素顯著增強TRAIL對HepG2細胞的殺傷活性和凋亡誘導活性，見表1。

表1 各組HepG2細胞活力和凋亡率比較（±s）

表1 各組HepG2細胞活力和凋亡率比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與 TRAIL 組比較，#P＜0.05，與川楝素組比較，amp;P＜0.05；與 TRAIL+川楝素組比較，□P＜0.05；TRAIL：腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體，DR5 siRNA：死亡受體5小干擾RNA

組別對照組TRAIL組川楝素組TRAIL+川楝素組TRAIL+川楝素+DR5 siRNA組孔數3 3 3 3 3相對細胞活力1.0±0.08 0.84±0.07*0.92±0.07 0.42±0.04#amp;0.76±0.06□細胞凋亡率（%）2.2±0.2 9.3±0.9*3.9±0.3 32.7±2.4#amp;13.8±1.1□

2.2 各組HepG2細胞表面DR5表達水平比較

Western blot實驗結果顯示，川楝素處理對HepG2細胞Bcl-2家族蛋白的表達無明顯影響但能顯著提高HepG2細胞DR5表達水平（見圖1，表2）。為了確定川楝素能否上調HepG2細胞表面DR5受體的表達，使用PE熒光標記的DR5抗體進行流式細胞實驗。結果顯示川楝素處理能提高HepG2細胞表面DR5受體的數量（見圖2）。另外，當轉染DR5 siRNA后，TRAIL聯合川楝素對HepG2細胞的殺傷活性和凋亡誘導活性均顯著下降（見表1），表明川楝素通過上調DR5表達提高HepG2細胞對TRAIL的敏感性。

圖1 各組HepG2細胞DR5表達水平

圖2 各組HepG2細胞表面DR5數量。DR5：死亡受體5

表2 各組HepG2細胞DR5表達水平比較（±s）

表2 各組HepG2細胞DR5表達水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TRAIL+川楝素組比較，□P＜0.05；Bcl-2：B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白；Bcl-xl：B 細胞淋巴瘤/白血病-2樣蛋白 1（BCL2-like1）；Bax：B細胞淋巴瘤/白血病-2相關X蛋白；DR5：死亡受體5蛋白；β-actin：肌動蛋白；TRAIL：腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體；DR5 siRNA：死亡受體5小干擾RNA。

組別對照組TRAIL組川楝素組TRAIL+川楝素組TRAIL+川楝素+DR5 siRNA組孔數3 3 3 3 3 Bcl-2相對表達水平0.76±0.06 0.79±0.07 0.72±0.05 0.77±0.06 0.73±0.05 Bcl-xl相對表達水平0.55±0.05 0.52±0.05 0.53±0.04 0.56±0.05 0.58±0.06 Bax相對表達水平0.37±0.04 0.40±0.05 0.34±0.04 0.38±0.05 0.35±0.04 DR5相對表達水平0.28±0.03 0.32±0.04 0.68±0.07*0.70±0.07*0.25±0.03□

2.3 川楝素促進HepG2細胞TRAIL誘導的線粒體途徑凋亡 流式細胞結果顯示，TRAIL+川楝素組HepG2細胞的相對線粒體膜電位顯著低于TRAIL單處理組和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA組（見表3）。Western blot結果顯示，TRAIL+川楝素組 HepG2細胞Cleaved Caspase-8表達水平及Cleaved Caspase-3表達水平均顯著高于TRAIL單處理組和川楝素+TRAIL+DR5 siRNA組（見圖3，表3）。

表3 各組HepG2細胞線粒體膜電位、Caspase-8、Caspase-3活化水平比較（±s）

表3 各組HepG2細胞線粒體膜電位、Caspase-8、Caspase-3活化水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與 TRAIL 組比較，#P＜0.05；與川楝素組比較，amp;P＜0.05；與 TRAIL+川楝素組比較，□P＜0.05；Cleaved Caspase-8：活化半胱天冬酶-8；Cleaved Caspase-3：活化半胱天冬酶-3；β-actin：肌動蛋白；TRAIL：腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體；DR5 siRNA為死亡受體5小干擾RNA

組別對照組TRAIL組川楝素組TRAIL+川楝素組TRAIL+川楝素+DR5 siRNA組孔數3 3 3 3 3線粒體膜電位1.00±0.07 0.78±0.06*0.97±0.07 0.26±0.02#amp;0.68±0.05□caspase-8 0.01±0.01 0.11±0.04*0.02±0.01 0.37±0.04#amp;0.14±0.02□caspase-3 0.01±0.01 0.13±0.02*0.04±0.01 0.42±0.04#amp;0.17±0.02□

圖3 各組HepG2細胞Caspase-8和Caspase-3活化

3 討論

川楝子是一味傳統中藥，它具有明顯的鎮(zhèn)痛作用且還可用于治療寄生蟲病，對諸如蛔蟲等有良好的殺滅作用。川楝素是川楝子中的主要活性成分，具有很強的藥理學活性。近年研究發(fā)現，川楝素還具有一定的抗腫瘤作用。在肺癌的治療中，川楝素能抑制肺癌細胞對藥物誘導的凋亡的抵抗性[6]；在結直腸癌的治療中，川楝素能抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其發(fā)生凋亡[7]；在白血病的治療中，川楝素能通過激活脫氧胞苷激酶促進白血病細胞的凋亡[8]。本研究發(fā)現，川楝素能顯著增強TRAIL對肝癌細胞的殺傷活性和凋亡誘導活性，表明川楝素與TRAIL存在協同效應，能提高TRAIL的抗肝癌活性。

在TRAIL信號通路中，TRAIL首先與死亡受體4（DR4）或死亡受體 5（DR5）結合形成死亡受體復合物，該復合物能募集細胞中的Caspase-8并使之發(fā)生活化?；罨腃aspase-8能剪切Bid蛋白使之成為活化形式?；罨腂id能轉位到線粒體外膜上，使腫瘤細胞的線粒體發(fā)生失能并打開線粒體外膜孔道，導致線粒體膜電位下降并使線粒體中的凋亡活性物質（如細胞色素C）通過線粒體外膜孔道釋放到細胞質中，從而誘導細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡[9-11]。Bcl-2家族蛋白成員是調控細胞凋亡的重要分子[12]。本研究結果發(fā)現川楝素處理并不能顯著影響肝癌細胞Bcl-2 家族蛋白成員（Bcl-2、Bcl-xl、Bax）的表達；研究發(fā)現，川楝素能顯著上調TRAIL的特異性受體DR5表達水平，同時增加肝癌細胞表面DR5的數量。當用小干擾RNA下調肝癌細胞表面DR5的表達后，川楝素對TRAIL的協同效應受到明顯抑制，證明川楝素可能通過增加肝癌細胞表面的DR5受體數量增強TRAIL依賴的凋亡信號，促使肝癌細胞發(fā)生Caspase-8活化，導致細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡。

總之，本研究顯示川楝素能顯著提高肝癌細胞對TRAIL的敏感性，增強TRAIL的抗腫瘤活性。

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Effect of Toosendanin on TRAIL Inhibiting Hepatocellular Carcinoma and the Related Mechanism

SHI Jie1,WANG Fang2.
1Clinical Laboratory,Cixi People's Hospital,Ningbo(315300),China；2Clinical Laboratory,Zhejiang Hospital,Hangzhou(310007),China

Objective To investigate the effect of toosendanin on enhancing the anti-tumor effect of TNF-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL） on hepatocellular carcinoma and the underlying mechanism.Methods HepG2 cells were divided into control group,toosendanin group,TRAIL group,toosendanin+TRAIL group and toosendanin+TRAIL+DR5 small interfering RNA（DR5 siRNA）group.CCK-8 assays were performed to evaluate the viability of HepG2 cells.Flow cytometry analysis was performed to detect the cell apoptosis and mitochondrial membrane potential in HepG2.Western blot and flow cytometry analysis was performed to evaluate the expression of DR5 on HepG2 cell surface and the activation of caspase-8 and caspase-3.Results Relative cell viability of HepG2 in TRAIL+toosendanin group（0.42±0.04） was significantly lower than that in TRAIL group（0.84±0.07,P＜0.05） and TRAIL+toosendanin+DR5 siRNA group（0.76±0.06,P＜0.05）.Apoptotic rate of HepG2 cells in TRAIL+toosendanin group（32.7±2.4）%was significantly higher than that in TRAIL group[（9.3±0.9）%,P＜0.05]and TRAIL+toosendanin+DR5 siRNA group[（13.8±1.1）%,P＜0.05].Treatment with toosendanin did not change the expression of Bcl-2 family proteins but significantly increased the expression of DR5 on the surface of HepG2.Relative mitochondrial membrane potential of HepG2 in TRAIL+toosendanin group（0.26±0.02） was significantly lower than that of TRAIL group（0.78±0.06,P＜0.05） and TRAIL+toosendanin+DR5 siRNA group（0.68±0.05,P＜0.05）.Relative expression of cleaved caspase-8（0.37±0.04） and cleaved caspase-3（0.42±0.04） in TRAIL+toosendanin group were both higher than the cleaved caspase-8（0.11±0.04） and cleaved caspase-3（0.13±0.02） in TRAIL group and the cleaved cas－pase-8（0.15±0.02） and cleaved caspase-3 （0.17±0.02） in TRAIL+toosendanin+DR5 siRNA group（all P＜0.05）.Conclusion Toosendanin enhances the anti-tumor effect of TRAIL by upregulating the expression of DR5 in hepatocellular carcinoma.

hepatocellular carcinoma;toosendanin;DR5;TRAIL

1浙江省慈溪市人民醫(yī)院檢驗科（寧波 315300）；2浙江醫(yī)院檢驗科（杭州 310007）

史杰，E-mail：cixishijie@163.com；Tel：15867236288

（收稿：2017-03-08 修回：2017-05-31）