核因子-κB p65在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

夏 庚， 祁 飛， 楊晉輝， 唐映梅， 石夢琳， 張峻崎

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科二病區(qū)， 昆明 650500 )

核因子-κB p65在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

夏 庚， 祁 飛， 楊晉輝， 唐映梅， 石夢琳， 張峻崎

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科二病區(qū)， 昆明 650500 )

目的利用肝癌組織芯片觀察核因子-κB(NF-κB) p65在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，探討其對肝癌發(fā)生、發(fā)展的意義。方法肝癌組織芯片(HLivH180Su05)包括81例癌組織和81例癌旁組織，手術(shù)時(shí)間為2006年5月-2007年5月，隨訪截止時(shí)間為2012年2月，其中復(fù)發(fā)46例，無復(fù)發(fā)35例；參考美國癌癥聯(lián)合會(huì)膽囊癌TNM分期(第7版)分為:Ⅰ期56例，Ⅱ期25例；有癌栓28例，無癌栓53例。利用免疫組化法檢測NF-κB P65蛋白的表達(dá)及相關(guān)性。依據(jù)所檢測蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，分別以檢測蛋白表達(dá)部位的陽性信號強(qiáng)度和陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)2種觀察標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合評分。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，采用log-rank時(shí)序檢驗(yàn)比較生存率。結(jié)果NF-κB p65蛋白在癌組織及癌旁組織表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)及部分細(xì)胞核，在癌組織及癌旁組織陽性率分別為90.12%、69.14%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.998，P=0.001)；癌組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)與臨床分期、癌栓、有無復(fù)發(fā)無明顯相關(guān)性(P值均>0.05)。結(jié)論NF-κB p65在肝癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，調(diào)控NF-κB功能的關(guān)鍵在于抑制RelA(p65)對肝腫瘤的促進(jìn)作用。由此推測，阻斷NF-κB p65活性能夠發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞分化、生長的作用，為臨床治療提供了新的思路。

癌, 肝細(xì)胞； NF-κB； 轉(zhuǎn)錄因子RelA

肝細(xì)胞癌(HCC)是全球第五大常見惡性腫瘤疾病，也是癌癥死亡率的第二大原因。2008年，我國HCC發(fā)病率男性為37.4/10萬人，女性為13.7/10萬人[1]，其中以41～60歲人群的發(fā)病率最高[2]。大多數(shù)HCC患者在確診后的3～6個(gè)月內(nèi)死亡，因此早期發(fā)現(xiàn)、早期治療對控制HCC病死率尤為重要。1986年核因子-κB(NF-κB)被首次發(fā)現(xiàn)，其能夠與活化B淋巴細(xì)胞的免疫球蛋白κ輕鏈增強(qiáng)子元件結(jié)合[3]。異常激活的NF-κB與癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，可作為癌癥的標(biāo)志物。NF-κB可通過以下方式促進(jìn)癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展：誘導(dǎo)抗凋亡基因的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的存活能力；誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白和原癌基因的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖；調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶和細(xì)胞黏附基因的表達(dá)促進(jìn)轉(zhuǎn)移；調(diào)節(jié)與癌組織新血管生長相關(guān)的基因刺激血管生成。本實(shí)驗(yàn)通過在肝癌組織芯片上檢測NF-κB p65的表達(dá)，探討其與HCC患者癌栓、分期及復(fù)發(fā)的關(guān)系，為HCC的早期診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 肝癌組織芯片(HLivH180Su05)購自上海芯超生物科技有限公司，共162芯，包括81例癌組織及81例癌旁組織；手術(shù)時(shí)間為2006年5月-2007年5月；隨訪截止時(shí)間為2012年2月，復(fù)發(fā)46例，無復(fù)發(fā)35例；參考美國癌癥聯(lián)合會(huì)膽囊癌TNM分期(第7版)[4]分為:Ⅰ期56例，Ⅱ期25例；有癌栓28例，無癌栓53例?？筃F-κB p65多克隆抗體購自Abcam公司。山羊抗兔二抗及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2 免疫組化 組織芯片脫蠟至水，PBS洗3次；3% H2O2滴加在切片上，室溫靜置，PBS洗3次；抗原修復(fù)，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液95 ℃，自然冷卻至室溫，PBS洗3次；滴加正常山羊血清封閉液，甩去多余血清；滴加兔抗人NF-κB p65多克隆抗體，4 ℃過夜；37 ℃復(fù)溫，PBS洗3次；滴加山羊抗兔二抗，PBS洗3次；DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，自來水沖洗；蘇木精復(fù)染，1%鹽酸分化，逐級乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。對照用NF-κB p65抗體稀釋液，結(jié)果應(yīng)為陰性。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)所檢測蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，分別以檢測蛋白表達(dá)部位的陽性信號強(qiáng)度和陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)2種觀察標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合評分。陽性表達(dá)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)陽性染色強(qiáng)度判斷，細(xì)胞無染色記0分；細(xì)胞呈淺棕色，弱陽性，記1分；細(xì)胞染成棕色，并無背景染色，或細(xì)胞呈深棕色、有淺棕色背景，為中等陽性，記2分；細(xì)胞呈深棕色，無背景著色，為強(qiáng)陽性，記3分。(2)根據(jù)陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)計(jì)分，陽性表達(dá)細(xì)胞<5%，計(jì)0分；陽性表達(dá)細(xì)胞≤25%，計(jì)1分；25%<陽性細(xì)胞數(shù)≤50%，計(jì)2分；陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)50%以上，為強(qiáng)陽性，計(jì)3分。最終計(jì)分結(jié)果分別按上述2種判斷標(biāo)準(zhǔn)得分乘積。最終判定評分：0分為陰性表達(dá)；1、2、3、4、6、9分為陽性表達(dá)；按照表達(dá)強(qiáng)度：0、1、2、3分為低表達(dá)組，4、6、9分為高表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，采用log-rank時(shí)序檢驗(yàn)比較生存率。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

NF-κB p65蛋白棕黃色陽性表達(dá)定位于肝癌組織、癌旁組織中的胞質(zhì)及部分胞核(圖1，2)。肝癌組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)陽性率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)；肝癌組織NF-κB p65蛋白陽性表達(dá)高于癌旁組織62例，占76.54%；肝癌組織與癌旁組織NF-κB p65蛋白陽性表達(dá)一致12例，占14.81%；肝癌組織NF-κB p65蛋白陽性表達(dá)較癌旁組織下調(diào)7例，占8.64%；肝癌組織Ⅰ期和Ⅱ期NF-κB p65高陽性表達(dá)率分別為71.43%(40/56)、84.00%(21/25)，NF-κB p65蛋白高陽性表達(dá)與肝癌分期無關(guān)(χ2=1.469，P=0.226)；肝癌組織有癌栓及無癌栓NF-κB p65高陽性表達(dá)率分別為67.86%(19/28)、79.25%(42/53)，NF-κB p65蛋白陽性表達(dá)與是否有癌栓無關(guān)(χ2=1.278，P=0.258)。

圖1 肝癌組織NF-κB p65蛋白陽性(蘇木精伊紅染色， ×20)

圖2 癌旁組織NF-κB p65蛋白陽性(蘇木精伊紅染色， ×20)

組別例數(shù)NF-κBp65蛋白陽性表達(dá)(例)陽性率(%)χ2值P值肝癌組織817390．12 10．998 0．001癌旁組織815669．14

本研究失訪1例，歸入未復(fù)發(fā)病例。肝癌組織NF-κB p65蛋白高表達(dá)與低表達(dá)分別為61、20例，其中未復(fù)發(fā)例數(shù)分別為23、12例。肝癌組織中NF-κB p65蛋白高表達(dá)與低表達(dá)無瘤生存曲線見圖3，肝癌組織中NF-κB p65蛋白高表達(dá)無瘤生存曲線總體位于NF-κB P65蛋白低表達(dá)無瘤生存曲線下方，但二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.123)。

圖3 肝癌組織中不同NF-κB p65蛋白表達(dá)無瘤生存曲線

3 討論

NF-κB是一種核蛋白因子，包括5個(gè)亞基因，分別為NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)、RelA(p65)、c-Rel和RelB。NF-κB廣泛存在于身體的多種細(xì)胞中，其參與多個(gè)生理、病理的基因調(diào)控過程，如炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞分裂、增殖及凋亡過程[5]。NF-κB是介導(dǎo)炎癥和腫瘤發(fā)生的主要內(nèi)在途徑。研究[6-7]顯示NF-κB與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與分化程度呈負(fù)相關(guān)。另有研究[8]顯示NF-κB在HCC組織中的表達(dá)水平是腫瘤分化程度和患者生存率的良好預(yù)測因子，NF-κB低表達(dá)的腫瘤患者比高表達(dá)者的存活時(shí)間更長。但NF-κB與性別、年齡、腫瘤直徑、肝硬化背景、Child-Pugh肝功能分級無明顯相關(guān)性[9]。NF-κB參與HCC發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚不清楚。有研究[10]表明NF-κB信號通過控制上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，有助于癌癥的進(jìn)展。有學(xué)者[11]提出膽固醇能夠進(jìn)一步激活NF-κB信號通路，促進(jìn)NF-κB靶基因的表達(dá)，NF-κB途徑能夠提升細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度，顯著增加HCC細(xì)胞對低密度脂蛋白的攝取。另外，NF-κB信號通路對AngⅡ誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞增殖和炎癥是必不可少的[12]，在HCC的發(fā)展過程中通過NF-κB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示NF-κB p65蛋白高表達(dá)組與臨床分期、癌栓及有無復(fù)發(fā)無明顯關(guān)系，原因可能與標(biāo)本的選擇及免疫組化的判斷方法有關(guān)，有待進(jìn)一步探討。但NF-κB p65蛋白在癌組織表達(dá)高于癌旁組織。在NF-κB的亞基中，p65的磷酸化是調(diào)節(jié)NF-κB活性的重要機(jī)制。Cao等[13]利用迷迭香酸通過調(diào)節(jié)與炎癥和血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子分泌以及抑制異種移植微環(huán)境中NF-κB p65的表達(dá)能有效抑制腫瘤生長、減少毒性作用。Li等[14]利用小檗堿通過NF-κB p65途徑促進(jìn)凋亡抑制HepG2細(xì)胞的生長，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示NF-κB p65水平以劑量依賴性方式顯著低于對照組。另外，當(dāng)用Pin1抑制劑處理HCC細(xì)胞時(shí)，磷酸化NF-κB p65表達(dá)和NF-κB活化減少，細(xì)胞增殖受到抑制[15]。有研究[16]表明NF-κB p65在肝癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，調(diào)控NF-κB功能的關(guān)鍵在于抑制RelA(p65)對肝腫瘤的促進(jìn)作用。由此推測，阻斷NF-κB p65活性能夠發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞分化、生長的作用，為臨床治療提供了新的思路。

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Expressionofnuclearfactor-kappaBp65inhepatocellularcarcinomaanditssignificance

XIAGeng,QIFei,YANGJinhui,etal.

(SecondDiseaseArea,DepartmentofGastroenterology,TheSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China)

ObjectiveTo investigate the expression of nuclear factor-kappa B (NF-κB) p65 in cancer tissue and adjacent tissue using hepatoma tissue microarray, as well as its significance in the development and progression of hepatocellular carcinoma (HCC).MethodsThe hepatoma tissue microarray HLivH180Su05 was used to analyze 81 cancer tissue samples and 81 adjacent tissue samples. Surgery was performed from May 2006 to May 2007, and the patients were followed up to February 2012. Of all patients, 46 experienced recurrence and 35 did not experience recurrence. According to the TNM staging of gallbladder carcinoma developed by the American Joint Committee on Cancer, 56 had stage I tumor and 25 had stage II tumor; 28 had tumor thrombus and 53 had no tumor thrombus. Immunohistochemistry was used to measure the expression of NF-κB p65, and its association with other factors was analyzed. On the basis of the localization of the protein to be measured, a comprehensive evaluation was performed based on the intensity of positive signal and the number of positive cells. The chi-square test was used for comparison of categorical data between groups, the Kaplan-Meier method was used for survival analysis, and the log-rank test was used for the comparison of survival rates.ResultsNF-κB p65 protein was located in the cytoplasm and some nuclei in cancer tissue and adjacent tissue, with positive rates of 90.12% in the cancer tissue and 69.14% in the adjacent tissue, and there was a significant difference in positive rate between the cancer tissue and the adjacent tissue (χ2=10.998,P=0.001). The expression of NF-κB p65 protein in cancer tissue was not associated with clinical stage, tumor thrombus, or the presence or absence of recurrence (allP>0.05).ConclusionHCC tissue has higher expression of NF-κB p65 than adjacent tissue. The key to the regulation of NF-κB function is to inhibit the promotional effect of RelA(p65) on liver tumor. Therefore, inhibiting the activity of NF-κB p65 may suppress the differentiation and growth of tumor cells, providing a new idea for clinical treatment of HCC.

carcinoma, hepatocellular； NF-kappa B； transcription factor RelA

R735.7

A

1001-5256(2017)12-2342-04

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.12.017

2017-06-15；修回日期：2017-07-04。 作者簡介：夏庚(1988- )，男，主要從事肝病診療方面的研究。 祁飛(1992- )，女，主要從事肝病診療方面的研究。 二者對本文貢獻(xiàn)相同，同為第一作者。 通信作者：唐映梅，電子信箱：tangyingmei_med@163.com。

引證本文：XIA G, QI F, YANG JH, et al. Expression of nuclear factor-kappa B p65 in hepatocellular carcinoma and its significance[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(12): 2342-2345. (in Chinese)

夏庚， 祁飛， 楊晉輝， 等. 核因子-κB p65在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(12): 2342-2345.

(本文編輯：邢翔宇)