（沈陽(yáng)藥科大學(xué) 遼寧 沈陽(yáng) 110016）

張冬娟 王世岳 蘇煬 蘇昕（通訊作者）

在感染性疾病中，厭氧菌感染占有很大比例，尤其是深部感染，嚴(yán)重者可危及生命[1]。奧硝唑?yàn)榈谌?-硝基咪唑的衍生物，已在多個(gè)國(guó)家廣泛應(yīng)用。其但具有良好抗菌效果的同時(shí)，帶來(lái)了一些副作用。所以研究方向逐漸向奧硝唑衍生物方向進(jìn)行。抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定對(duì)正確指導(dǎo)嚴(yán)重感染治療的療效具有重要價(jià)值。發(fā)達(dá)國(guó)家的MIC測(cè)定已經(jīng)逐漸成為常規(guī)藥敏實(shí)驗(yàn)的主體，鑒于方法學(xué)的良好性能，該法已經(jīng)成為藥敏實(shí)驗(yàn)的候選參考方法[2]。而日本化學(xué)療法學(xué)會(huì)制定的微量液體稀釋法被稱為測(cè)定抗菌素對(duì)病原菌MIC 的標(biāo)準(zhǔn)方法[3]，本試驗(yàn)采用微量液體稀釋法測(cè)定奧硝唑衍生物體外抗菌效果。

1.材料

1.1 主要材料

實(shí)驗(yàn)菌株：消化鏈球菌（沈陽(yáng)藥科大學(xué)）

Brain Heart Infusion肉湯培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）

瓊脂粉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）

氯化鈉（分析純）（天津市大茂化學(xué)試劑廠）

二甲基亞砜（DMSO）（天津永大化學(xué)試劑有限公司）

無(wú)菌脫纖維羊血（沈陽(yáng)鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）

蒸餾水（沈陽(yáng)藥科大學(xué)）

上述培養(yǎng)基pH自然，采用高壓蒸汽滅菌：115℃，30min。

奧硝唑（沈陽(yáng)藥科大學(xué)）

25種奧硝唑衍生物（編號(hào)S2LA-01～S2LA-25）（沈陽(yáng)藥科大學(xué)）

溶劑二甲基亞砜（DMSO）

生理鹽水：0.85%生理鹽水

1.2 主要設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）凈化工作臺(tái)（沈陽(yáng)利港凈化設(shè)備有限公司）培養(yǎng)箱（37℃）細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)管

2.方法

2.1 準(zhǔn)備濕熱滅菌物品及超凈工作臺(tái)內(nèi)物品。需115℃濕熱滅菌30min的物品。

2.2 增菌：將無(wú)菌Brain Heart Infusion肉湯瓊脂培養(yǎng)基加入適量無(wú)菌脫纖維羊血，使其含量達(dá)到5%，然后每支試管內(nèi)加入4ml制成斜面并接種。

2.3 試驗(yàn)

（1）將陽(yáng)性對(duì)照藥奧硝唑標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)化合物用100%二甲基亞砜充分溶解為2560μg/ml 濃度后，除菌過(guò)濾。

（2）在96孔板的每排標(biāo)記上“待測(cè)化合物、陽(yáng)性對(duì)照品和標(biāo)準(zhǔn)菌株”等的編號(hào)和順序，取除菌后的化合物原液20μl，加入96 孔板1號(hào)孔中，再在1號(hào)孔中加入180μl 的肉湯培養(yǎng)液，2～11號(hào)孔中加入100μl培養(yǎng)液，11號(hào)孔作為菌株生長(zhǎng)情況對(duì)照，12 號(hào)孔中加入200μl 培養(yǎng)液留作空白對(duì)照。從1～10號(hào)孔依次用移液槍吸取前一孔的液體100μl，加入后一孔，直至第10孔后棄去最后的100μl。

（3）生長(zhǎng)后的菌，用3～5ml 生理鹽水溶解，校正濃度至0.5 麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，再用含10%脫纖維羊血肉湯稀釋1∶100（含菌量約為106cfu/ml），渦旋混勻。然后在96孔板的1～11號(hào)孔中加入100μl菌液，采用二倍稀釋的方法，使化合物最終濃度為 128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml 和 0.25μg/ml。11 號(hào)孔檢測(cè)菌是否生長(zhǎng)，12號(hào)孔檢測(cè)肉湯是否被污染。

（4）每個(gè)板必須有陽(yáng)性對(duì)照品，待測(cè)化合物均按以上步驟稀釋。同種化合物需做兩組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。96孔板密封于厭氧袋中37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)。

2.4 結(jié)果判斷

黑色背景下觀察，微孔混濁或孔底沉淀認(rèn)為有菌生長(zhǎng)。無(wú)菌生長(zhǎng)孔所含最低抗菌藥物的濃度即為MIC值。

3.結(jié)果與結(jié)論

結(jié)果：S2LA-01、S2LA-02、S2LA-06、S2LA-07這四種化合物的抗菌活性都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照藥奧硝唑，而S2LA-03～S2LA-05化合物的活性雖然高于奧硝唑標(biāo)準(zhǔn)品，但是作用效果不如S2LA-01、S2LA-02、S2LA-06、S2LA-07這四種化合物明顯。S2LA-08～S2LA-20這13種化合物抗菌效果均不好，其中S2LA-08、S2LA-10、S2LA-13、S2LA-20這四種化合物的抗菌效果不如奧硝唑標(biāo)準(zhǔn)品。S2LA-24化合物抗菌結(jié)果穩(wěn)定，且抗菌作用強(qiáng)，抗菌效果優(yōu)于同組其他化合物。結(jié)論：篩選出5種抗菌效果相對(duì)優(yōu)良的化合物，分別是MIC值為0.50μg/ml的S2LA-01、S2LA-02、S2LA-24和MIC值為0.25μg/ml的S2LA-06、S2LA-07。

4.討論

通過(guò)本次試驗(yàn)篩選出的5 種化合物，在體外抗厭氧菌效果上明顯優(yōu)于奧硝唑，為進(jìn)一步藥物篩選奠定基礎(chǔ)。

[1]蘇建榮，馬紀(jì)平.實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展厭氧菌檢查的重要性[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30(1)：12-13.

[2]陳秀樞，屠湧濤.微量肉湯稀釋法測(cè)定MIC 的評(píng)價(jià)[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)雜志,1994,17(3)：2.

[3]陳昌福，孟長(zhǎng)明.微量液體稀釋法測(cè)定MIC[J].漁業(yè)致富指南，2004,24：59-60.