龍 門 ，孫夢(mèng)媛 ，謝 文 ，周 卉 ，王 冉

（1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；2. 滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽省熱敏性物料加工工程技術(shù)中心，滁州 239000）

0 引 言

噬菌體廣泛存在于自然界中（水、土壤、空氣），烈性噬菌體可感染或裂解細(xì)菌，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用在對(duì)人類細(xì)菌感染的治療方面[1-2]。近年來(lái)，噬菌體殺菌已經(jīng)取得了重大的突破，表現(xiàn)為彎曲桿菌[3]，大腸桿菌[4]，腸桿菌[5]，假單胞菌[6]，熱死環(huán)絲菌[7]，沙門菌[8]和李斯特菌[9]等均有大量研究。從食品安全的角度來(lái)說(shuō)，噬菌體是預(yù)防和控制一些不需要的細(xì)菌，而不干擾自然生物群落細(xì)菌的最佳方式[10-11]。噬菌體無(wú)毒，不僅可以提高食品的安全性，而且也不會(huì)改變食物的色、香、味[12]，在溫度低至1℃時(shí)仍然能夠裂解宿主細(xì)胞，可抑制冷藏食品中細(xì)菌（特別是嗜冷菌）的生長(zhǎng)，并且一旦食品取出置于室溫條件下，噬菌體便可進(jìn)一步控制其增殖。JS25噬菌體從牛奶場(chǎng)污水中分離，屬于肌尾噬菌體科噬菌體，具有極強(qiáng)的細(xì)菌裂解能力，可以較好的感染并殺死宿主細(xì)胞[13]；該類噬菌體在應(yīng)用至食品殺菌中的優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在，噬菌體沒(méi)有遺傳功能，并且不能轉(zhuǎn)錄細(xì)菌DNA，主要是通過(guò)感染殺死宿主細(xì)胞[14]。

雖然噬菌體具有巨大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，并且已經(jīng)取得了廣泛的應(yīng)用，但是由于其保存時(shí)間相對(duì)較短的特點(diǎn)也限制了在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用范圍。研究表明，浮游狀態(tài)的噬菌體穩(wěn)定性極差，在室溫條件下貯藏6～12 h后即失活，嚴(yán)重制約了其應(yīng)用范圍[15-16]。微囊化技術(shù)是一種常用的活性物質(zhì)包埋技術(shù)，該技術(shù)不但可以通過(guò)包埋法固定活性物質(zhì)以提高其穩(wěn)定性，還可以通過(guò)包埋技術(shù)調(diào)控活性物質(zhì)的釋放速率，以增加活性物質(zhì)的應(yīng)用可能性[15-16]。目前已經(jīng)在功能性油脂、益生菌等醫(yī)藥、食品包裝、生物技術(shù)、環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域取得了重大的研究成果[17-20]。但是該技術(shù)在針對(duì)JS25噬菌體的微囊化及其結(jié)構(gòu)表征的研究應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)海藻酸鈉微囊化JS25噬菌體，并對(duì)制備的JS25噬菌體微囊粉進(jìn)行結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性進(jìn)行表征，通過(guò)分析JS25噬菌體微囊粉在不同液態(tài)食品中的釋放規(guī)律、穩(wěn)定性及對(duì)液態(tài)食品的生物防制作用確定其抑菌保鮮功效，以期為液態(tài)食品提供一種適用的非熱殺菌新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

vB_SauM_JS25噬菌體（以下簡(jiǎn)稱JS25噬菌體）由江蘇省農(nóng)科院食品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所提供，分離自奶牛場(chǎng)污水；金黃色葡萄球菌 ATCC6538購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司；鮮牛奶購(gòu)自南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司；雞蛋清分離自新鮮雞蛋，購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；營(yíng)養(yǎng)肉湯購(gòu)自安徽綠源生物科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（lysogeny broth，LB）、Baird-Parker培養(yǎng)基購(gòu)自青島新希望生物科技有限公司；MgSO4、CaCl2、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、海藻酸鈉、鹽酸等所有生化試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司，分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

LRH-250A生化培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；TXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FA2204B 電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；R-134A型恒溫振蕩搖床，美國(guó)熱電公司；JL-1166型激光粒度分布測(cè)試儀，成都精新粉體測(cè)試設(shè)備有限公司；JSM-6510掃描電鏡，日本電子株式會(huì)社。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 JS25噬菌體微囊粉的制備表征

1）溶液配制[21-22]

① SM緩沖液：稱取硫酸鎂2 g，明膠0.1 g，氯化鈉5.8 g，溶解于900 mL去離子水中，再加入50 mL、1 mol/L的Tris-HCl溶液，去離子水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

② 微球破解液（mierosphere-brokensolution，MB）：稱取檸檬酸鈉14.7 g，碳酸氫鈉16.8 g，溶于1L的SM緩沖液中，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2）海藻酸鈉微囊化JS25噬菌體制備流程[23-24]

① 將4 ℃保存的金黃色葡萄球菌噬菌體JS25采用液體增值法擴(kuò)增培養(yǎng)至1011PFU/g（浮游態(tài)JS25噬菌體）。

② 將3.5 g海藻酸鈉溶解于100 mL、50 mmol/L Tris-HCl溶液中（pH值=7.5），然后加入噬菌體懸液，攪拌混勻，噬菌體終濃度分別為 108、109、1010、1011、1012PFU/g，真空脫氣除去溶液中氣泡。③ 將上述溶液用2 mL無(wú)菌注射器逐滴滴入100 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%CaCl2溶液中形成海藻酸鈣凝膠，（20± 2）℃靜置硬化30 min。④ 過(guò)濾收集微球，用去離子水洗滌后，冷凍干燥（將制備好的微球放入冰箱內(nèi)進(jìn)行預(yù)凍結(jié), 溫度-20℃，冷凍時(shí)間 24 h；其后進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥機(jī)的冷阱溫度為 -50 ℃，干燥室壓力 60 Pa,干燥8 h）制備微囊粉，備用。

3）JS25噬菌體微囊粉的表征

針對(duì)上述試驗(yàn)制備的JS25噬菌體微囊粉，分析其粒徑分布情況及掃描電鏡結(jié)果。

4）JS25噬菌體微囊粉的穩(wěn)定性分析

以浮游態(tài)JS25噬菌體為對(duì)照，分別分析在微囊化前后JS25噬菌體在4 ℃及20 ℃貯藏0、0.25、0.5、1、7、14、21、28、35 d過(guò)程中的效價(jià)變化。

1.2.2 JS25噬菌體微囊粉在液態(tài)食品中的釋放及穩(wěn)定性

1）JS25噬菌體微囊粉在液態(tài)食品中釋放規(guī)律

將JS25噬菌體微囊粉按照添加量為1.0 g/kg分別添加至鮮牛奶、蛋清液、肉湯 3種液態(tài)食品中，并于震蕩混合1、5、10、15、20、25、30、60 min時(shí)確定不同食品中噬菌體的效價(jià)，并以 MB為對(duì)照，確定不同液態(tài)食品中噬菌體微囊粉的釋放率。

2）JS25噬菌體微囊粉在液態(tài)食品中穩(wěn)定性

將JS25噬菌體微囊粉按照添加量為1 g/kg分別添加至鮮牛奶、蛋清液、肉湯 3種液態(tài)食品中，分別于震蕩混合0.25（6 h）、1、2、3、6、9、12 d時(shí)檢測(cè)不同食品中噬菌體效價(jià)，以浮游態(tài)JS25噬菌體為對(duì)照。

1.2.3 JS25噬菌體微囊粉對(duì)液態(tài)食品中致病菌的生物防制作用

1）液態(tài)食品樣品處理方法

分別取鮮牛奶、蛋清液、肉湯3種液態(tài)食品10 g于無(wú)菌取樣瓶中，4 ℃冷藏備用。將金黃色葡萄球菌37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用緩沖液稀釋金黃色葡萄球菌濃度至2×103CFU/mL，按照1∶1（體積比）添加至上述液態(tài)食品中，混合均勻后，使菌落數(shù)為103CFU/g。

2）JS25噬菌體微囊粉對(duì)液態(tài)食品中致病菌的生物防制作用

將JS25噬菌體微囊粉分別按照質(zhì)量比為0、0.1、0.5、1.0、2.0 g/kg添加至上述的液態(tài)食品中。上述不同處理的液態(tài)食品混勻后分別貯藏于4及20 ℃中，于第0、0.25（6 h）、1、2、3、6、9、12 d時(shí)檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌的數(shù)量。

1.2.4 方法測(cè)定

JS25噬菌體效價(jià)測(cè)定：首先將金黃色葡萄球菌宿主菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期備用。將純化好的噬菌體 VB_SauM_JS25用SM緩沖液梯度稀釋，取合適倍數(shù)的稀釋液0.1 mL和對(duì)數(shù)期金黃色葡萄球菌菌體于5 mL半固體培養(yǎng)基中混勻后預(yù)先準(zhǔn)備好的固體平板上。制成雙層平板，等平板凝固后倒置，放在37 ℃培養(yǎng)箱里面培養(yǎng)24 h，第2天觀察噬菌斑的個(gè)數(shù)。噬菌體的效價(jià)（PFU/mL）=噬菌斑數(shù)目×稀釋倍數(shù)。

包埋率測(cè)定：取5 g微囊粉成品加入15 mL SM緩沖液中 37 ℃水化 15 min，然后將水化后的微囊粉加入45 mL MB中，20 ℃溶解1 h后，檢測(cè)破解液中噬菌體效價(jià)。包埋率為微囊粉中JS25噬菌體效價(jià)與初始噬菌體效價(jià)之比（%）。

釋放率測(cè)定[25]：釋放率的計(jì)算方式為JS25噬菌體微囊粉在不同液體中的噬菌體效價(jià)與在破解液中的效價(jià)之比具體見(jiàn)公式（1）。

其中M1為JS25噬菌體微囊粉在不同液態(tài)食品中的效價(jià)；M2為JS25噬菌體在MB中噬菌體的效價(jià)。

粒徑測(cè)定[26]：采用馬爾文納米粒度基于動(dòng)態(tài)光散射原理測(cè)定儀測(cè)定JS25噬菌體微囊粉的平均粒徑。

掃描電鏡：取適量JS25噬菌體微囊粉，將其用膠粘附于鋁制的樣品載物臺(tái)上，再放入真空噴涂?jī)x內(nèi)進(jìn)行蒸鍍Au/Pd，最終于JSM-6510掃描電鏡下觀察形態(tài)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，用SAS 9.2進(jìn)行ANOVA分析，不同平均值之間利用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（X±SD，n=3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 JS25噬菌體微囊粉制備及結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 JS25噬菌體微囊粉制備

表1為不同初始噬菌體效價(jià)時(shí)，JS25噬菌體微囊粉的包埋率。從圖中可以看出，當(dāng)JS25噬菌體微囊粉的效價(jià)超過(guò) 1010PFU/g時(shí)，微囊粉中噬菌體包埋率顯著（P＜0.05）增加。為了提高JS25噬菌體微囊粉的包埋率及被包埋的 JS25噬菌體效價(jià)，本研究選對(duì)效價(jià)為 12 lg（PFU/g）的初始噬菌體進(jìn)行包埋，得到微囊粉中噬菌體效價(jià)為11.94 lg（PFU/g），包埋率為87.4%。

表1 JS25噬菌體微囊粉制備Table 1 preparation of JS25 phage microencapsulated powder

2.1.2 JS25噬菌體微囊粉結(jié)構(gòu)表征

1）掃描電鏡結(jié)果

為了表征JS25噬菌體的顆粒形態(tài)，通過(guò)掃描電鏡對(duì)JS25噬菌體微囊粉（圖1b）及海藻酸鈉凝膠（圖1a）進(jìn)行表征后可以看出，微囊粉呈均勻的顆粒狀分布，而海藻酸鈉膠體大致呈網(wǎng)狀、塊狀結(jié)構(gòu)。

圖1 掃描電鏡結(jié)果（放大倍數(shù)×5000）Fig.1 Scanning electron microscopy results(magnification times×5000)

2）JS25噬菌體微囊粉粒徑分布

對(duì)試驗(yàn)得到的JS25噬菌體微囊粉進(jìn)行粒徑分析后可以看出，微囊粉粒徑范圍在20～90μm之間，且呈正態(tài)分布。其中粒徑范圍在30～50μm之間的微囊粉約占比60%；說(shuō)明試驗(yàn)中得到的JS25噬菌體微囊粉顆粒均勻，該工藝能有效、均勻的完成對(duì)噬菌體的包埋。

2.2 JS25噬菌體微囊粉的穩(wěn)定性結(jié)果

圖3為不同溫度條件下JS25噬菌體微囊粉的穩(wěn)定性結(jié)果。從圖中可以看出，在 4 ℃時(shí)，浮游態(tài)噬菌體在貯藏1 d時(shí)，效價(jià)從9.0 lg（PFU/mg）迅速至0。而JS25噬菌體微囊粉在貯藏35 d后，效價(jià)呈輕微的降低。在20℃時(shí)，浮游態(tài)噬菌體在6 h后即失活至0，而噬菌體微囊粉在1 d后呈略微的降低，在貯藏35 d后，效價(jià)從8.94 lg（PFU/mg）降低至 7.54 lg（PFU/mg）（P＜0.05），僅下降1.4 lg（PFU/mg）。

圖2 JS25噬菌體微囊粉粒徑分布Fig.2 JS25 phage particle size distribution

圖3 JS25噬菌體微囊粉穩(wěn)定性結(jié)果Fig.3 JS25 phage microcapsules stability results

2.3 JS25噬菌體微囊粉在液態(tài)食品中釋放規(guī)律

JS25噬菌體在不同食品模擬體系中的釋放規(guī)律見(jiàn)圖4。從圖中可以看出，在不同種類的液態(tài)食品體系中，JS25噬菌體具有相似的釋放規(guī)律，均表現(xiàn)為在0～30 min快速釋放，在30 min時(shí)釋放率均超過(guò)90%。另外，對(duì)比不同食品中噬菌體的釋放速率可以看出，JS25噬菌體微囊粉在鮮牛奶中的釋放速率最高，在20 min后釋放率可達(dá)到80%以上，其次為肉湯，在20 min釋放率可達(dá)到83.89%；JS25噬菌體微囊粉在蛋清液中的釋放速率相對(duì)較低，表現(xiàn)為在20 min后釋放率僅為73.22%。因此可以看出，微囊粉狀的JS25噬菌體在不同的液態(tài)食品中均能有效的釋放，可以用于液態(tài)食品的生物防制中。

圖4 JS25噬菌體微囊粉在液態(tài)食品中的釋放規(guī)律Fig.4 JS25 phage microcapsules release curve in liquid food

2.4 JS25噬菌體微囊粉在液態(tài)食品中穩(wěn)定性結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證JS25噬菌體微囊粉在不同液態(tài)食品中的應(yīng)用可行性，通過(guò)檢測(cè)在不同的貯藏溫度及貯藏過(guò)程中，JS25噬菌體在液態(tài)食品中的效價(jià)結(jié)果見(jiàn)圖 5。從圖中可以看出，在4 ℃及20 ℃貯藏過(guò)程中，JS25噬菌體在鮮牛奶及肉湯中效價(jià)均有輕微的增長(zhǎng)，但是無(wú)顯著差異（P＞0.05）；即JS25噬菌體在牛奶及肉湯中具有極高的穩(wěn)定性。另外，JS25噬菌體在蛋清液中的穩(wěn)定性結(jié)果可以看出，在4 ℃及20 ℃貯藏過(guò)程中，JS25噬菌體效價(jià)顯著（P＜0.05）降低，表現(xiàn)為在貯藏12d后噬菌體效價(jià)分別降低1.10及1.60 lg（PFU/mg）。綜合試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在4及20 ℃的貯藏過(guò)程中，JS25噬菌體在液態(tài)食品中均有較高的穩(wěn)定性。

圖5 JS25噬菌體微囊粉在液態(tài)食品中的穩(wěn)定性Fig.5 JS25 phage microcapsules stability in liquid food

2.5 JS25噬菌體微囊粉對(duì)液態(tài)食品中生物防制作用

2.5.1 JS25噬菌體微囊粉對(duì)鮮牛奶中致病菌生物防制效果

不同添加量的JS25噬菌體微囊粉對(duì)鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的生物防制作用結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖中可以看出，不同量的JS25噬菌體對(duì)鮮牛奶中的金黃色葡萄球菌均有極強(qiáng)的抑制作用，具體表現(xiàn)在不同溫度條件下（4或 20℃），當(dāng)JS25噬菌體微囊粉添加量為0.1 g/kg時(shí)，隨著鮮牛奶貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，牛奶中金黃色葡萄球菌總數(shù)急劇下降，當(dāng)貯藏時(shí)間為3 d時(shí)，金黃色葡萄球菌數(shù)量降低至0.1 lg（CFU/g）左右，隨著貯藏時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至6 d，菌落數(shù)降低至 0；并且隨著 JS25噬菌體添加量增加至0.5 g/kg，牛奶中金黃色葡萄球菌總數(shù)在貯藏3 d時(shí)降低至0；當(dāng)JS25噬菌體微囊粉繼續(xù)增加至0.5 g/kg時(shí)，不同溫度條件下下鮮牛奶中金黃色葡萄球菌迅速降低至0。

2.5.2 JS25噬菌體微囊粉對(duì)蛋清液中致病菌生物防制效果

圖7為不同JS25噬菌體微囊粉對(duì)蛋清液的生物防制作用結(jié)果。從圖中可以看出，不同溫條件下，隨著 JS25噬菌體微囊粉添加量的增加，對(duì)蛋清液中的生物防制作用不斷加強(qiáng)，具體表現(xiàn)為在JS25噬菌體微囊粉添加量為0.1 g/kg時(shí)，不同溫度條件下菌落總數(shù)在貯藏3～12 d時(shí)不斷增加，在貯藏12 d時(shí)，4 ℃及20 ℃蛋清液中的菌落數(shù)分別為5.44及6.89 lg（CFU/g）；隨著JS25噬菌體微囊粉添加量增加至0.5 g/kg，4 ℃貯藏0～12 d時(shí)，蛋清液菌落數(shù)持續(xù)降低至1.21 lg（CFU/g），但是在20 ℃貯藏條件下，蛋清液中的菌落數(shù)增長(zhǎng)至3.22 lg（CFU/g）；當(dāng)JS25噬菌體微囊粉添加量增加至1.0 g/kg時(shí)，噬菌體對(duì)蛋清液的生物防制作用顯著（P＜0.05）提高，表現(xiàn)為在貯藏0～6 d，金黃色葡萄球菌數(shù)急劇減少，在4 ℃及20 ℃貯藏6 d菌落數(shù)降低至0。

圖6 JS25噬菌體微囊粉對(duì)鮮牛奶金黃色葡萄球菌抑制作用Fig.6 Inhibition effect of JS25 phage microencapsulated powder on staphylococcus aureus in fresh milk

圖7 JS25噬菌體微囊粉對(duì)蛋清液金黃色葡萄球菌抑制作用Fig.7 Inhibition effect of JS25 phage microencapsulated powder on staphylococcus aureus in liquid egg white

2.5.3 JS25噬菌體微囊粉對(duì)肉湯中致病菌生物防制效果

JS25噬菌體對(duì)肉湯中的生物防制作用結(jié)果與蛋清液中的趨勢(shì)相似，均表現(xiàn)為隨著JS25噬菌體微囊粉添加量的增加，食品中的菌落總數(shù)顯著降低，具體見(jiàn)圖8。從圖中可以看出，在不同溫度的貯藏過(guò)程中，JS25噬菌體微囊粉在添加量為2.0 g/kg時(shí)，肉湯中的金黃色葡萄球菌數(shù)在貯藏4～6 d降低至0；當(dāng)添加量低于1.0 g/kg時(shí)，肉湯中在貯藏過(guò)程中的菌落數(shù)相對(duì)較高。

圖8 JS25噬菌體微囊粉對(duì)肉湯金黃色葡萄球菌抑制作用Fig.8 Inhibition effect of JS25 phage microencapsulated powder on staphylococcus aureus in broth

3 討 論

3.1 JS25噬菌體微囊粉穩(wěn)定性

JS25噬菌體作為一種天然的殺菌劑廣泛應(yīng)用到食品保鮮中，以增強(qiáng)食品的安全性和延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，但是天然噬菌體大多為浮游態(tài)，極易失活，從而限制了其在食品保鮮加工中的應(yīng)用[27-28]。從試驗(yàn)掃描結(jié)果可以看出，通過(guò)海藻酸鈉-CaCl2體系可以將噬菌體包埋為微米級(jí)別的微囊粉，但是微囊粉呈不規(guī)則的圓球狀，可能是因?yàn)楹Ｔ逅徕c在擠出階段或在 CaCl2溶液中硬化過(guò)程中導(dǎo)致，但是也有研究報(bào)道可能是由于噬菌體表面和海藻酸鈉之間的相互作用導(dǎo)致[29]。另外，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在20 ℃條件下，浮游態(tài)噬菌體在6 h即失活，而微囊粉態(tài)噬菌體在貯藏35 d僅失活15.66%，說(shuō)明微囊粉能有效實(shí)現(xiàn)對(duì)JS25噬菌體的包埋。

3.2 JS25噬菌體生物防制作用

釋放性能是載藥微囊粉的重要性能指標(biāo)，既可以保持活性物質(zhì)在體系中不斷釋放，也可以提高活性物質(zhì)的穩(wěn)定性，從而達(dá)到長(zhǎng)效作用。但是，從圖5中可以看出，JS25噬菌體微囊粉在不同液態(tài)食品中的釋放速率存在差異，可能是由于液態(tài)食品中的水分活度及流動(dòng)性不同導(dǎo)致，這也是JS25噬菌體在不同液態(tài)食品中表現(xiàn)出不同穩(wěn)定性的原因。Polk[30]通過(guò)對(duì)殼聚糖-海藻酸鈉微膠囊中白蛋白的釋放規(guī)律發(fā)現(xiàn)，不同溶液中水分活度越高、離子強(qiáng)度越低，微囊粉中的活性物質(zhì)具有越快的釋放速率。

試驗(yàn)結(jié)果表明，JS25噬菌體在液態(tài)食品中的防制作用主要依賴于噬菌體的效價(jià)，對(duì)比不同食品在貯藏過(guò)程中的金黃色葡萄球菌總數(shù)得到，JS25噬菌體微囊粉在鮮牛奶、蛋清液及肉湯中的添加量分別為0.1 g/kg、1.0 g/kg及2.0 g/kg時(shí)，對(duì)食品中的微生物有較強(qiáng)的抑制作用。因此可以看出，JS25噬菌體微囊粉對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果會(huì)因食品種類的不同而存在差別，與 Guenther[31]的研究結(jié)果相似。主要原因可能是食品本身的性質(zhì)（pH值、離子強(qiáng)度及水分活度）及噬菌體效價(jià)導(dǎo)致的[31]。

4 結(jié) 論

1）海藻酸鈉和CaCl2組成的體系能有效地完成對(duì)初始效價(jià)為11.94 lg（PFU/g）的JS25噬菌體的包埋，并且試驗(yàn)中得到的JS25噬菌體微囊粉有穩(wěn)定的顆粒結(jié)構(gòu)，其顆粒粒徑在20～90 μm之間呈正態(tài)分布，且噬菌體包埋率為87.4%。另外，該狀態(tài)的噬菌體穩(wěn)定性顯著增加，表現(xiàn)為與浮游態(tài)噬菌體失活相比，4 ℃及20 ℃條件下噬菌體貯藏35 d也有較高的效價(jià)。

2）微囊粉狀的 JS25噬菌體在不同的液態(tài)食品中均能有效的釋放， 均表現(xiàn)為在0～30 min快速釋放，在30 min時(shí)釋放率均超過(guò)90%，并且在4 ℃及20 ℃的貯藏過(guò)程中，JS25噬菌體在液態(tài)食品中穩(wěn)定性顯著增加（P＜0.05）。

3）JS25噬菌體微囊粉對(duì)不同液態(tài)食品的生物防制結(jié)果表明，當(dāng)S25噬菌體微囊粉添加量超過(guò)0.1、1.0、2.0 g/kg時(shí)，分別對(duì)鮮牛奶、蛋清液及肉湯中的致病菌有較強(qiáng)的清除作用。

[1] Ananou S, Maqueda M, Martínez-Bueno M, et al. Control of staphylococcus aureus in sausages by enterocin AS-48[J].Meat Science, 2014, 24(71): 549－56.

[2] Chao-Guang C, Fabri L J, Wilson M J, et al. One-step zero-back ground IgG reformatting of phage-displayed antibody fragments enabling rapid and high-throughput lead identification [J]. Nucleic Acids Research, 2014, 42(4): 194－201.

[3] Tomat D, Quiberoni A, Casabonne C, et al. Phage adsorption on enteropathogenic and shiga toxin-producing escherichia coli strains: Influence of physicochemical and physiological factors [J]. Food Research International, 2014, 66(66): 23－28.

[4] Goode D, Allen V M, Barrow P A. Reduction of experimental salmonella and campylobacter contamination of chicken skin by application of lytic bacteriophages [J].Applied & Environmental Microbiology, 2003, 69(8): 5032－5036.

[5] O'Flynn G, Ross R P, Fitzgerald G F, et al. Evaluation of a cocktail of three bacteriophages for biocontrol of escherichia coli O157: H7. [J]. Applied & Environmental Microbiology,2004, 70(6): 3417－3424.

[6] Kim K P, Klumpp J, Loessner M J. Enterobacter sakazakii bacteriophages can prevent bacterial growth in reconstituted infant formula[J]. International Journal of Food Microbiology,2007, 115(2): 195－203.

[7] Greer G G. Homologous bacteriophage control of pseudomonas growth and beef spoilage. [J]. Journal of Food Protection, 1986, 49(2): 104－109.

[8] Greer G G, Dilts B D. Control of brochothrix thermosphacta spoilage of pork adipose tissue using bacteriophages [J].Journal of Food Protection, 2002, 65(5): 861－863.

[9] Modi R, Hirvi Y, Hill A, et al. Effect of phage on survival of salmonella enteritidis during manufacture and storage of cheddar cheese made from raw and pasteurized milk. [J].Journal of Food Protection, 2001, 64(7): 927－933.

[10] Guenther S, Huwyler D, Richard S, et al. Virulent bacteriophage for efficient biocontrol of listeria monocytogenes in ready-to-eat foods[J]. Applied &Environmental Microbiology, 2009, 75(1): 93－100.

[11] Jochen K, Julia D, Rudi L, et al. The terminally redundant,nonpermuted genome of Listeria bacteriophage A511: a model for the SPO1-like myoviruses of gram-positive bacteria. [J]. Journal of Bacteriology, 2008, 190(17): 5753－5765.

[12] El-Arabi T F, Griffiths M W, She Y M, et al. Genome sequence and analysis of a broad-host range lytic bacteriophage that infects the Bacillus cereus group[J].Virology Journal, 2013, 10(1): 1－11.

[13] Lang L H. FDA approves use of bacteriophages to be added to meat and poultry products[J]. Gastroenterology, 2006，131(5): 1370－1372.

[14] Ma Y L, Lu C P. Isolation and identification of a bacteriophage capable of infecting streptococcus suis type 2 strains[J]. Veterinary Microbiology, 2008, 132(34): 340－347.

[15] Díezmartínez R, De Paz H D, Garcíafernández E, et al. A novel chimeric phage lysin with high in vitro and in vivo bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. [J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2015, 70(6): 1763－1773.

[16] Oliveira H, Boas D V, Mesnage S, et al. Structural and enzymatic characterization of ABgp46, a novel phage endolysin with broad anti-Gram-Negative bacterial activity[J].Frontiers in Microbiology, 2016, 7(e108376): 208－217.

[17] 陳水林. 微膠囊技術(shù)及其對(duì)織物印花之應(yīng)用[J]. 印染,1998, 24(9):28-31.Cheng S. Microcapsule technology and it's application to fabric printing[J]. Dyeing & Finishing, 1998, 24(9) : 28－31.

[18] 朱麗云, 孫培龍, 張立欽. 微生物農(nóng)藥微膠囊技術(shù)及其應(yīng)用前景[J]. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 19(1): 109－112.Zhu Liyun, Sun Peilong, Zhang Lixin. Microcapsule technology and application prospects of microbial pesticide[J].Journal of Zhejiang Forestry College, 2002, 19(1): 109－112.

[19] O Brien C M. Effect of varying the microencapsulation process on the functionality of hydrogenated vegetable fat in short dough biscuits [J]. Food research international, 2003,36: 215-221.

[20] Burgain J, Gaiani C, Linder M, et al. Encapsulation of probiotic living cells: From laboratory scale to industrial applications[J]. Journal of Food Engineering, 2011, 104(4):467－483.

[21] Miyagawa A M, Inui T, Nakajima K, et al. Thermal microcapsule transfer technology for full-color printing controlled by photo and thermal energies[J]. Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering, 1990,1253(7): 264－270.

[22] 王培祥，劉云，王濤，等. 微膠囊技術(shù)在洗滌劑中的應(yīng)用[J]. 日用化學(xué)工業(yè), 2006, 36(4):239-242.Wang P X, Liu Y, Wang T, et al. Application of microcapsule technology in detergent[J]. China Surfactant Detergent & Cosmetics, 2006, 36(4): 239－242.

[23] Li Z, Chen P, Xu X, et al. Preparation of chitosan–sodium alginate microcapsules containing ZnS nanoparticles and its effect on the drug release[J]. Materials Science &Engineering C, 2009, 29(7): 2250－2253.

[24] Mazumder M A, Burke N A, Shen F, et al. Core-cross-linked alginate microcapsules for cell encapsulation [J].Biomacromolecules, 2009, 10(6): 1365－1373.

[25] Bekhit M, Sánchez-González L, Messaoud G B, et al. Design of microcapsules containing Lactococcus lactis subsp. lactis in alginate shell and xanthan gum with nutrients core[J].LWT-Food Science and Technology, 2016, 68: 446－453.

[26] Antoniou J, Liu F, Majeed H, et al. Physicochemical and morphological properties of size-controlled chitosan–tripolyphosphate nanoparticles[J]. Colloids &Surfaces A Physicochemical & Engineering Aspects, 2015,465: 137－146.

[27] Maresca D, Prisco A D, Storia A L, et al. Microencapsulation of nisin in alginate beads by vibrating technology:Preliminary investigation[J]. LWT-Food Science and Technology, 2016, 66: 436－443.

[28] Prisco A D, Maresca D, Ongeng D, et al. Microencapsulation by vibrating technology of the probiotic strain Lactobacillus reuteri, DSM 17938 to enhance its survival in foods and in gastrointestinal environment[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 61(2): 452－462.

[29] Whelehan M, Marison I W. Microencapsulation using vibrating technology[J]. Journal of Microencapsulation, 2011,28(8): 669－688.

[30] Polk A, Amsden B, De Yao K, et al. Controlled release of albumin from chitosan—alginate microcapsules[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 1994, 83(2): 178－185.

[31] Guenther S, Huwyler D, Richard S, et al. Virulent bacteriophage for efficient biocontrol of listeria monocytogenes in ready-to-eat foods[J]. Applied &Environmental Microbiology, 2009, 75(1): 93－100.