汪凱文 陳德慶

【摘 要】目的：探究microRNA-21對成骨細(xì)胞增殖和凋亡的作用。方法：應(yīng)用PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后的成骨細(xì)胞中microRNA-21的表達(dá)水平；應(yīng)用CCK-8實驗檢測microRNA-21對成骨細(xì)胞增殖能力的影響；應(yīng)用TUNEL實驗檢測microRNA-21對成骨細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染microRNA-21 mimics后，成骨細(xì)胞中microRNA-21的表達(dá)顯著升高，而轉(zhuǎn)染microRNA-21 AMO后，成骨細(xì)胞中microRNA-21的表達(dá)顯著降低；CCK-8實驗結(jié)果表明，microRNA-21 能夠顯著升高成骨細(xì)胞增殖能力；TUNEL結(jié)果表明，microRNA-21能夠抑制成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)論：microRNA-21能夠顯著升高成骨細(xì)胞增殖能力，并抑制其發(fā)生凋亡，從而可能參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】miRNA；骨質(zhì)疏松；成骨細(xì)胞；增殖；凋亡

【中圖分類號】R968 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1005-0019（2018）20-0-01

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種以骨密度降低、骨微觀結(jié)構(gòu)受損、骨量減少、骨強(qiáng)度下降，引起骨脆性及分離度增加的全身代謝性骨骼疾病[1]。骨質(zhì)疏松患者容易出現(xiàn)胸廓畸形、骨痛和駝背等癥狀，嚴(yán)重時將發(fā)生骨折[2]。骨質(zhì)疏松的主要發(fā)病原因之一是破骨細(xì)胞性骨吸收與成骨細(xì)胞性骨形成平衡失調(diào)[3]。因此，成骨細(xì)胞在維持骨平衡和骨代謝中發(fā)揮重要功能。MicroRNAs（miRNAs）是一類存在于所有真核細(xì)胞、由大約22個核苷酸組成的非編碼RNA，具有組織特異性和發(fā)育階段特異性[4]。miRNAs通過和其靶點mRNA特異性結(jié)合，使其降解或抑制其翻譯，從而調(diào)控基因的表達(dá)，最終在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、個體生長發(fā)育及疾病的發(fā)生與發(fā)展等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[5]。本研究探究microRNA-21對成骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并尋找治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵microRNA，為臨床治療骨質(zhì)疏松提供新的靶點和方向。

1 材料與方法

1.1 材料 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo，美國），倒置光學(xué)顯微鏡（Nikon，日本），microRNA-21及陰性對照、所有引物設(shè)計和合成（吉瑪，中國廣州），逆轉(zhuǎn)錄儀、PCR儀（羅氏，德國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人成骨細(xì)胞系MC3T3-E1采用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL的青-鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（Thermo公司，美國）。培養(yǎng)24 h后置于倒置光學(xué)顯微鏡（Nikon公司，日本）下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代比例一般為1：2或1：3。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將細(xì)胞接種于小皿或96孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%-60%，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑X-treme進(jìn)行轉(zhuǎn)染。microRNA-21 mimics和microRNA-21 AMO轉(zhuǎn)染濃度分別為50 nM和100 nM。轉(zhuǎn)染6 h后更換含有10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液以維持細(xì)胞正常生長，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 PCR檢測microRNA-21的表達(dá)：應(yīng)用TRIZOL提取樣品中總RNA，測定濃度和純度，待用。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，使用逆轉(zhuǎn)錄儀將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20℃，待用。在PCR板中分別加入10 μL的SYBR Green，7 μL蒸餾水，2 μL目的基因的引物及1 μL cDNA，總體系為20 μL，在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)CT值，計算microRNA-21的表達(dá)情況。

1.2.4 CCK-8實驗：將96孔板中的培養(yǎng)液棄凈，每孔加入100 μL無血清單純培養(yǎng)基，并加入10 μL的CCK-8試劑，呈“十”字輕輕晃動培養(yǎng)板，充分混勻后，避光置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，孵育4 h后，采用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞的吸光度值，并計算增殖能力。

1.2.5 TUNEL染色：成骨細(xì)胞以1×105/cm2密度接種到小皿中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到40%-50%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染或加藥48 h后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞后，室溫下用穿透液于穿透細(xì)胞60 min，PBS清洗三次后加入TUNEL反應(yīng)混合液，在37 ℃避光濕盒中搖床孵育1 h。PBS漂洗3次后，用封閉液封閉20 min，PBS清洗細(xì)胞3次后，用染色液4 ℃搖床孵育過夜。次日，用DAPI染色液孵育20 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞，并統(tǒng)計結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，并分析差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，*p < 0.05，**p < 0.01和 ***p < 0.001，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染microRNA-21 mimics后，成骨細(xì)胞中microRNA-21的表達(dá)顯著升高，而轉(zhuǎn)染microRNA-21 AMO后，成骨細(xì)胞中microRNA-21的表達(dá)顯著降低，說明轉(zhuǎn)染效率較高；CCK-8實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染microRNA-21 mimics后，成骨細(xì)胞增殖能力顯著升高，而轉(zhuǎn)染microRNA-21 AMO后，成骨細(xì)胞增殖能力顯著降低；TUNEL染色結(jié)果說明，轉(zhuǎn)染microRNA-21 mimics后，成骨細(xì)胞凋亡比例顯著降低，而轉(zhuǎn)染microRNA-21 AMO后，成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例顯著升高，說明microRNA-21抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥（ Osteoporosis） 是一種以骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加，骨折危險性增加為特征的全身性代謝骨病。防治骨質(zhì)疏松癥及其并發(fā)癥已逐漸成為骨科領(lǐng)域亟待解決的嚴(yán)重問題之一。骨組織是重要的結(jié)締組織，起著支撐身體以及保護(hù)內(nèi)臟器官的作用。正常生理條件下，骨微環(huán)境中骨組織會發(fā)生重建，主要是成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，正常情況下，這兩者處于動態(tài)平衡。骨重建過程中的這種平衡被打破將會引起人體病理生理改變，骨質(zhì)疏松的發(fā)病原因是骨吸收速率增加，使骨形成少于骨吸收，最終導(dǎo)致骨總量降低。因此，如何提高成骨細(xì)胞生物學(xué)功能是治療骨質(zhì)疏松的重要靶點。

綜上所述，microRNA-21能夠顯著升高成骨細(xì)胞增殖能力，并抑制其發(fā)生凋亡，從而可能參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展。本研究為臨床治療骨質(zhì)疏松提供新的靶點和思路，為microRNA應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松提供實驗基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

王愛飛，王亮，and 徐又佳，MicroRNAs對骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展.中國骨質(zhì)疏松雜志，2018（1）： p.135-140.

倪夢杉，et al.，治療骨質(zhì)疏松和骨折何時聯(lián)用或介入抗骨質(zhì)疏松治療.中國組織工程研究，2018.22（4）： p.625-630.