孫 華，李仲賢

(梅州市人民醫(yī)院廣梅院區(qū)口腔門診，廣東 梅州 514031)

種植義齒是牙列缺損及缺失的常見的修復(fù)方式之一，大約30%的種植修復(fù)的患者會發(fā)生種植體周圍炎[1]，這種復(fù)雜的炎癥及免疫病理過程是導(dǎo)致種植體失敗的主要原因。菌斑是種植體周圍組織炎癥的主要致病因素，炎癥微環(huán)境可以導(dǎo)致破骨作用，使支持骨喪失，最終導(dǎo)致種植義齒修復(fù)失敗。研究證實，種植體周圍炎的發(fā)生直接影響種植牙的成功率。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，在骨形成過程中要經(jīng)歷成骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟、細(xì)胞外基質(zhì)礦化和成骨細(xì)胞凋亡4個階段。很多因素可調(diào)節(jié)這幾個階段，從而最終調(diào)控骨形成。種植體周圍炎治療的傳統(tǒng)方法，包括局部清創(chuàng)、刮治及抗菌藥物應(yīng)用，整體治療效果并不十分理想。并且抗菌藥物應(yīng)用因其對宿主細(xì)胞毒性及細(xì)菌的耐藥性，使其應(yīng)用具有一定爭議[2]。本試驗以體外培養(yǎng)種植體周圍炎來源及正常組織來源的人成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)為研究對象，重點觀察炎性微環(huán)境對成骨細(xì)胞增殖、分化成熟方面的影響。為抑制牙周炎、種植體周圍炎等所致牙槽骨的吸收，促進(jìn)骨再生提供理論依據(jù)，促進(jìn)種植修復(fù)技術(shù)的臨床推廣。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 胎牛血清、胰蛋白酶、 培養(yǎng)液DMEM(Gibco公司)、茜素紅(AZR)染料、二甲基亞砜(DMSO)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色及活性試劑盒、骨鈣素(osteocalcin，OCN)放免試劑盒。

1.2 成骨細(xì)胞原代分離培養(yǎng) 取種植體脫落患者種植窩中骨組織及口腔頜面外科手術(shù)中獲得的無菌骨碎片，在DMEM 全培養(yǎng)液中輕刮骨內(nèi)表面并反復(fù)沖洗，將骨片剪成碎片，將其置入培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)瓶倒置放入CO2培養(yǎng)箱，靜置4 h后，取出培養(yǎng)瓶小心翻轉(zhuǎn)。每3 d換液1次，每次換液后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、運動及貼壁情況。待細(xì)胞數(shù)量足夠，0.25%胰酶消化傳代。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與功能鑒定 (1)ALP染色：將細(xì)胞爬片3 d后取出，按照試劑盒說明書染色，光鏡觀察。(2)鈣結(jié)節(jié)染色：將細(xì)胞爬片18 d后取出，茜素紅染色5 min，二甲苯透明，樹膠封固，光鏡觀察。

1.4 進(jìn)行炎性微環(huán)境對成骨細(xì)胞功能影響的試驗

1.4.1 試驗分組 將種植體周圍炎來源成骨細(xì)胞組設(shè)為試驗組，將正常組織來源成骨細(xì)胞組設(shè)為對照組。

1.4.2 成骨細(xì)胞增殖能力檢測(MTT法) 取傳代第三代細(xì)胞，胰蛋白酶消化離心加入DMEM培養(yǎng)液，形成OB混懸液，接種于96孔板。每24 h每組取3孔，收集細(xì)胞，加入MTT溶液孵育4 h，加二甲基亞砜，酶標(biāo)儀測定490 nm處各管吸光度值(A值)，繪制生長曲線。整個試驗重復(fù)3次。

1.4.3 堿性磷酸酶活性 取傳代第三代細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞測定各管OD值。根據(jù)計算公式計算出蛋白含量。按照AKP測定試劑盒說明書操作，據(jù)計算公式計算出各組細(xì)胞勻漿液AKP的含量。整個試驗重復(fù)3次。

1.4.4 骨鈣素檢測 取傳代第三代細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞上清液作骨鈣素檢測。按骨鈣素放射免疫試劑盒所提供的放射免疫法(RIA)測定細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中的骨鈣素含量。整個試驗重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 試驗所得數(shù)據(jù)應(yīng)用Microsoft Excel及SPSS 11.5軟件，采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行兩組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)后成骨細(xì)胞的鑒定

2.1.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 兩種來源細(xì)胞原代培養(yǎng)第1天，貼壁的細(xì)胞開始形成突起。此時細(xì)胞體積小，呈短梭形、三角形或多邊形。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞以三角形及方形為主，生長快而穩(wěn)定，就細(xì)胞形態(tài)而言，兩組細(xì)胞無明顯差異。

2.1.2 堿性磷酸酶染色 兩種來源細(xì)胞傳3代以后，ALP染色顯示大部分培養(yǎng)細(xì)胞呈陽性，細(xì)胞漿有藍(lán)染顆?；驂K狀沉淀，為ALP陽性反應(yīng)。但對照組比試驗組細(xì)胞內(nèi)可見更多染色顆粒。

2.1.3 鈣結(jié)節(jié)染色 細(xì)胞生長8～14 d細(xì)胞融合后繼續(xù)培養(yǎng)，即呈多層生長，培養(yǎng)18～30 d，倒置顯微鏡下觀察可見在瓶底的不透光結(jié)節(jié)，茜素紅染色可見結(jié)節(jié)處有橘紅色鈣鹽沉積，證實為鈣化結(jié)節(jié)。對照組比試驗組細(xì)胞內(nèi)可見更多鈣結(jié)節(jié)。

2.2 成骨細(xì)胞成骨功能觀察

2.2.1 成骨細(xì)胞增殖能力測定 結(jié)果表明，兩組細(xì)胞都表現(xiàn)了一定的增殖能力，對照組增殖能力明顯高于試驗組，從貼壁培養(yǎng)第4天，兩組細(xì)胞增殖能力有顯著性差異(P<0.05)。

2.2.2 堿性磷酸酶(ALP)活性 試驗組ALP活性(4.21±0.25)U/gprot，對照組ALP活性(8.91±0.29)U/gprot，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明兩組均可使成骨細(xì)胞ALP活性增強，對照組ALP活性高于試驗組。

2.2.3 骨鈣素(OCN)檢測 試驗組OCN含量(2.40±0.26)ng/mL，對照組OCN含量(3.40±0.36)ng/mL，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明兩組均可使成骨細(xì)胞OCN含量增加，對照組OCN表達(dá)高于試驗組。

3 討 論

種植義齒修復(fù)經(jīng)過長期的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用，已經(jīng)逐漸普及，與之相應(yīng)的種植體周圍炎的患者日趨增多，因種植體周圍骨吸收導(dǎo)致種植體脫落占脫落種植體的97.06%，現(xiàn)已成為種植修復(fù)一大難題。

種植體周圍炎早期主要研究相關(guān)炎癥細(xì)胞因子及細(xì)菌微生物對骨細(xì)胞的影響，與骨吸收的關(guān)系，研究已證實齦溝液中IL-1α、IL-6、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子參與炎癥過程 ，與界面骨破壞有關(guān)[3]。目前，在種植體周圍炎的治療上，針對細(xì)胞及免疫病理方面的研究較多，Bhattarai等[4]證實，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)主要表達(dá)于脂肪組織和免疫系統(tǒng)，通過結(jié)合殼聚糖納米金粒子，在植入物表面可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞礦化，抑制種植體周圍炎。還有學(xué)者研究釉基質(zhì)衍生物可以影響植入物表面OB的增殖及分化，褪黑素可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的代謝[5-6]，都具有一定的應(yīng)用前景。丁元圣等[7]研究表明，含氟鎂合金正畸微種植體可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，對種植體周圍炎能起到一定的抑制作用。常壓低溫等離子體(cold atmospheric plasma，CAP)能夠破壞細(xì)菌生物膜，增加鈦表面潤濕度，有利于成骨細(xì)胞的附著，可能被用于種植體周圍炎的治療[8]。骨形成蛋白2和牙周膜干細(xì)胞在種植體周圍炎形成的缺損處可增加新骨的形成，并重新形成骨整合[9]。骨形成蛋白2/7異質(zhì)二聚體也可增加骨再生[10]。

成骨細(xì)胞的鑒別除細(xì)胞形態(tài)外主要依靠成骨細(xì)胞的特異性分泌蛋白，如堿性磷酸酶、骨鈣素及體外礦化的功能特征。長期以來各研究者均以具有以上特征作為成骨細(xì)胞鑒定標(biāo)準(zhǔn)，因而將這些特點稱為成骨細(xì)胞表型標(biāo)志[11-12]。

本試驗細(xì)胞通過形態(tài)學(xué)同時結(jié)合成骨細(xì)胞的3項特征性指標(biāo)，證實培養(yǎng)的細(xì)胞為成骨細(xì)胞，并有鈣化能力。種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞的增殖及分化能力均低于正常組織來源的成骨細(xì)胞。這是由于種植體周圍炎的炎性微環(huán)境抑制了成骨細(xì)胞的增殖能力。種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞由于在炎性微環(huán)境下降低了OCN 的表達(dá)，與以往研究相符合[13]。種植體與頜骨的骨結(jié)合區(qū)骨密度越高，種植體與骨的結(jié)合率就越高[14]。

炎性微環(huán)境下成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能受多方面調(diào)控，通過對比可以確定炎性微環(huán)境下成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能受到影響，成骨分化及礦化能力顯著降低，這是導(dǎo)致種植體周圍骨組織吸收的主要原因[15]。本試驗在細(xì)胞層面進(jìn)一步探討種植體周圍炎的病因，從而為疾病防治提供了方向。

[1]SCHMINKE B， ORDE F V， GRUBER R， et al. The pathology of bone tissueduring peri-implantitis[J]. J Dent Res， 2015， 94(2)： 354-361.

[2]BUSSCHER H J， VAN DER MEI H C， SUBBIAHDOSS G， et al. Biomaterial-associated infection： locating the finish line in the race for the surface[J]. Science Translational Medicine，2012， 4： 153rv10.

[3]徐淑蘭，張開宜，許曼波，等.實驗性種植體周圍炎齦溝液炎癥細(xì)胞因子濃度的檢測分析[J].廣東牙病防治，2003(2)：30-32.

[4]BHATTARAI G， LEE Y H， LEE N H， et al. PPAR delivered by Ch-GNPs onto Titanium surfaces inhibits implant-induced inflammation and induces bone mineralization of MC-3T3E1 osteoblast-like cells[J]. Clin Oral Implants Res， 2013， 24(10)： 1101-1109.

[5]QU Z， ANDRUKHOV O， LAKY M， et al. Effect of enamel matrix derivative on proliferation and differentiation of osteoblast cells grown on the Titanium implant surface[J]. Oral Surgery， Oral Medicine， Oral Pathology， Oral Radiology， and Endodontology， 2011， 111(4)： 517-522.

[6]PROKSCH S， STROBEL S L， VACH K A， et al. Melatonin as a candidate therapeutic drug for protecting bone cells from chlorhexidine-induced damage[J]. J Periodontol， 2014， 85(12)： E379-E389.

[7]丁元圣，趙玥，郭睿，等.不同正畸微種植體對骨結(jié)合和種植體周圍炎的影響[J].醫(yī)學(xué)信息，2015，28(26)：69-70.

[8]DUSKE K， JABLONOWSKI L， KOBAN I， et al. Cold atmospheric plasma in combination with mechanical treatment improves osteoblast growth on biofilm covered Titanium discs[J]. Biomaterials， 2015， 52： 327-334.

[9]PARK S Y， KIM K H， GWAK E H， et al. Ex vivo bone morphogenetic protein 2 gene delivery using periodontal ligament stem cells for enhanced re-osseointegration in the regenerative treatment of peri-implantitis[J]. J Biomed Mater Res A， 2015， 103(1)： 38-47.

[10]SUN P， WANG J X， ZHENG Y N， et al. BMP2/7 heterodimer is a stronger inducer of bone regeneration in peri-implant bone defects model than BMP2 or BMP7 homodimer[J]. Dent Mater J， 2012， 31(2)： 239-248.

[11]閆愛民，劉力，陳秉禮，等.兔胚成骨細(xì)胞移植修復(fù)異體兔骨缺損的實驗研究[J].創(chuàng)傷外科雜志，2003，5(2)：110-113.

[12]XU Y H， SHI X Y， HU Y Y， et al. The histocompatibility of true bone ceramic and cultured rabbit poriatoum osteoblast in vitro[J]. Fourth Mil Med Univ， 2000， 21(4)： 512-514.

[13]PACIOS S， ANDRIANKAJA O， KANG J， et al. Bacterial infection increases periodontal bone loss in diabetic rats through enhanced apoptosis[J]. Am J Pathol， 2013， 183(6)： 1928-1935.

[14]REICH K， TANGL S， GOLDHAHN J， et al. Cortical porosity of the mandible in an osteoporotic sheep model[J]. Osteoporosis International， 2010， 21(1)： 311.

[15]吳昊，劉洪臣，鄂玲玲，等.種植體周圍炎對頜骨成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2014，32(2)：130-133.