肖歡，寧宗

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

碳基納米材料由于其卓越的性能使其在各領域有廣泛的應用前景。在這些碳納米材料中，石墨烯是最新和最重要的材料之一。2004年，石墨烯由Geim和Novoselov從石墨中分離出來，此后，掀起了對石墨烯的研究熱潮[1]。石墨烯基材料(GBMs)主要包括氧化石墨烯、還原性氧化石墨烯和功能化石墨烯。GBMs比表面積高，具有極好的電學、熱學及光學性能，在光電領域、能量轉(zhuǎn)換和儲存、催化反應和環(huán)境應用等領域有著廣泛的應用前景[2～4]。近年GBMs在生物成像、癌癥診斷、基因傳遞、組織工程、生物傳感、DNA序列分析和藥物輸送等生物醫(yī)學領域的潛在應用引起了科學界的高度重視[5～7]。但是，隨著GBMs研究及應用的深入，其生物安全性的問題也逐漸受到關注。由于體內(nèi)試驗的局限性，對于GBMs生物安全性的探究主要集中在體外細胞毒性的研究。近年對于GBMs通過何種途徑內(nèi)化、內(nèi)化后定位于何種亞細胞器、對于這些亞細胞又有何種影響，國內(nèi)外研究團隊從不同角度給出了答案，但尚未見有相關系統(tǒng)性綜述。本文首次對GBMs體外細胞毒性的研究進行了系統(tǒng)總結(jié)，并展望了其在探究GBMs生物安全性方面的意義。

1 GBMs的內(nèi)化途徑

研究表明，GBMs內(nèi)化是導致細胞中毒的機制之一；但同時也有研究表明GBMs內(nèi)化可以運輸治療性藥物到細胞，并且可以降低細胞耐藥性[8]。類似于富勒烯、碳納米管等其他納米材料，GBMs主要通過胞吞作用(網(wǎng)格蛋白介導的胞吞作用、細胞膜穴位內(nèi)陷介導的內(nèi)吞作用、巨胞飲作用、吞噬作用)內(nèi)化到細胞中，GBMs內(nèi)化到細胞中的途徑受顆粒尺寸大小的影響。Mu等[9]將蛋白包裹的氧化石墨烯納米片按尺寸分離，并發(fā)現(xiàn)大尺寸的氧化石墨烯納米片主要通過吞噬作用進入小鼠間充質(zhì)祖細胞C2C12，小尺寸氧化石墨烯納米片主要通過網(wǎng)格蛋白介導的胞吞作用進入細胞。Wu等[10]對氧化石墨烯的研究也表明了其內(nèi)化途徑呈尺寸依賴性。表面化學修飾也影響著GBMs的內(nèi)化。Chatterjee等[11]發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯能被HepG2細胞內(nèi)化，而還原性氧化石墨烯因其疏水性更強，大部分被吸附到細胞表面而沒有被內(nèi)化。值得注意的是，GBMs內(nèi)化到細胞中的途徑與細胞類型有關。在某些類型的細胞中，不同尺寸大小的氧化石墨烯和還原性氧化石墨烯薄片都可以通過內(nèi)吞途徑被細胞有效地攝入。Linares等[12]通過胞吞抑制劑來研究氧化石墨烯納米片被成骨細胞Saos-2、肝癌細胞HepG2和巨噬細胞RAW-264.7攝取的內(nèi)吞途徑差異。他們發(fā)現(xiàn)在三種細胞系中巨胞飲作用是一種普遍的內(nèi)化過程，此外，氧化石墨烯可以通過微管依賴途徑進入Saos-2細胞，通過網(wǎng)格蛋白介導的胞吞作用進入HepG2和RAW-264.7細胞。Xiong等[13]的研究表明，三維納米石墨烯(NG納米粒)通過網(wǎng)格蛋白介導的胞吞作用進入人肝癌細胞HepG2，通過網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白共同介導的內(nèi)吞作用進入人正常肝細胞系HL7702，發(fā)現(xiàn)HepG2細胞對三維納米石墨烯的攝取效率更高，并且三維納米石墨烯對HepG2細胞的細胞毒性遠高于HL7702細胞。所以GBMs的內(nèi)化途徑主要和材料的尺寸大小、表面性質(zhì)及細胞類型有關；對于不同的內(nèi)化途徑，GBMs的攝取效率不同、細胞毒性也有差異。

2 GBMs對細胞膜的影響

GBMs可以通過主動插入切割細胞脂膜，將大量的磷脂分子從細胞脂膜抽離，從而破壞細胞膜(主要由磷脂雙分子層組成)的完整性導致細胞死亡。有研究表明，GBMs也能通過間接機制影響膜的完整性和動力學。Xu等[14]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，原始氧化石墨烯通過調(diào)節(jié)和細胞骨架相關的基因包括肌動蛋白抗體Actg2、肌球蛋白Tubb2a和伴肌動蛋白Nebulin，可能會損害細胞膜的完整性和功能。

GBMs對細胞膜的影響與濃度有關。低濃度的GBMs在細胞中表現(xiàn)出低毒性或沒有毒性；相反，高濃度的GBMs在其內(nèi)化期間改變了細胞膜的動力學和完整性，誘導細胞凋亡或壞死。Li等[15]將GLC-82肺癌細胞暴露于高濃度的氧化石墨烯中48 h，誘導細胞質(zhì)中乳酸脫氫酶的重新分布，細胞膜完整性遭到破壞。在其他細胞類型如乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231和胰腺癌細胞Panc-1中也有類似的結(jié)果[16]，表明細胞暴露于高濃度的GBMs會損害膜的完整性。

GBMs的比表面積和形狀對細胞膜有明顯影響。Akhavan等[17]合成還原石墨烯納米片并評估了尺寸依賴性的人骨髓間充質(zhì)干細胞的毒性。該細胞活力測試顯示平均橫向尺寸為(11±4)nm的還原石墨烯納米片在1.0 μg/mL時，有明顯的細胞毒性；而橫向尺寸為(3.8±0.4)μm的還原性氧化石墨烯片僅在濃度高達100 μg/mL，暴露1 h后才有細胞毒性作用。說明同樣材料組成的納米顆粒與微顆粒相比，納米顆粒毒性更大，原因可能是隨著納米顆粒減小、其表面積會增大，所以在評價不同尺寸固體顆粒(特別是介于納米到微米之間)的毒性時，以顆粒的比表面積作為毒性評估標準比尺寸更為恰當。Chng等[18]比較了氧化石墨烯納米帶和氧化石墨烯納米片的細胞毒性，發(fā)現(xiàn)縱向拉伸碳納米管得到的氧化石墨烯納米帶比片狀氧化石墨烯納米片顯示更強的細胞毒性。GBMs的表面化學修飾也影響其與細胞膜的相互作用，如利用聚乙二醇、聚乙烯亞胺、殼聚糖等對GBMs進行共價或非共價修飾能減輕其細胞毒性[19]。

綜上所述，隨著GBMs被細胞攝取，對細胞膜也產(chǎn)生了一定影響。GBMs對細胞膜的影響與與納米粒的濃度、比表面積、形狀、表面化學性質(zhì)密切相關，這些研究拓展了對其理化性質(zhì)新的了解，有助于開發(fā)理化性質(zhì)更為安全的GBMs。

3 GBMs對溶酶體的影響

GBMs進入細胞后通常位于內(nèi)體/溶酶體系統(tǒng)。Chen等[20]研究顯示，功能化氧化石墨烯內(nèi)化后主要分布在乳腺癌細胞4T1的酸性溶酶體中。石墨烯能淬滅熒光染料，為了檢測溶酶體中石墨烯的存在，Zhou等[21]將乳腺癌細胞MDA-MB-231用溶酶體特異性熒光探針標記，通過共聚焦顯微鏡觀察到部分溶酶體的熒光淬滅，表明石墨烯位于溶酶體附近或內(nèi)部。

GBMs對溶酶體的影響呈劑量依賴性。低濃度的GBMs幾乎不影響溶酶體膜的完整性，因此不影響細胞活力。然而，高濃度的GBMs能引起溶酶體膜的通透性增加，易導致細胞死亡，包括溶酶體/線粒體依賴性的細胞凋亡，溶酶體依賴性的細胞壞死和溶酶體依賴性的自噬細胞死亡[22]。最近，GBMs對細胞自噬的影響吸引了越來越多的關注。有研究表明，氧化石墨烯在巨噬細胞溶酶體中累積導致溶酶體膜不穩(wěn)定，減少了自噬小體的降解[23]。鑒于GBMs對細胞溶酶體和細胞自噬表現(xiàn)出的潛在毒性機制，應提高GBMs在生物醫(yī)學應用的安全性。

4 GBMs對線粒體的影響

內(nèi)化的GBMs可定位到線粒體中，干擾其結(jié)構和功能，導致細胞代謝與功能的損傷，從而誘發(fā)疾病。因此，探索GBMs和線粒體之間相互作用的機制是非常有價值的。Li等[15]使用透射電子顯微鏡觀察到人肺腺癌細胞GLC-82線粒體中氧化石墨烯的累積。

有研究者[24]發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯能進入胎鳉科魚肝癌細胞系PLHC-1并定位于線粒體中，破壞線粒體膜完整性與通透性，使線粒體膜電位降低、細胞內(nèi)活性氧簇增多。Zhou等[21]將氧化石墨烯與乳腺癌細胞MDA-MB-231共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯定位于線粒體及其周圍，引起線粒體膜去極化和線粒體膜電位降低；同時發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯在線粒體內(nèi)呈劑量依賴性抑制Fe-S中心在電子傳遞過程將Fe3+還原成Fe2+的能力，抑制琥珀酸脫氫酶活性和電子傳遞鏈復合物活性，由此干擾線粒體的產(chǎn)能過程。Li等[22]發(fā)現(xiàn)，原始石墨烯能引起鼠單核細胞系RAW 264.7線粒體膜發(fā)生去極化，呈時間和劑量依賴性引起活性氧簇增加及線粒體膜電位下降，并且激活由線粒體介導的細胞凋亡；同時促使Bim(Bcl-2家族凋亡蛋白前體)激活，進而引起B(yǎng)cl-2家族凋亡蛋白Bax積累，使線粒體外膜通透性增加、凋亡因子前體釋放入胞質(zhì)，引起Caspase級聯(lián)反應，從而誘導細胞凋亡。

5 GBMs對細胞核及細胞骨架的影響

細胞核是遺傳物質(zhì)的主要存儲中心，能調(diào)控細胞的生命活動。GBMs能進入細胞核，引起基因毒性。Jin等[25]報道，氧化石墨烯可以進入人肺腺癌細胞A549，定位于細胞質(zhì)和細胞核。Zhang等[26]將納米石墨烯片與人成骨樣細胞MG63共培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)部分納米石墨烯片進入細胞核；并且發(fā)現(xiàn)納米石墨烯片被MG63細胞攝取后，能損傷亞細胞器結(jié)構，促進細胞凋亡。Qiao等[27]比較了氧化石墨烯(2 μm)和其他納米材料(50 nm)在人成纖維細胞中的DNA毒性，發(fā)現(xiàn)不同的材料引起DNA損傷的程度有所差異，并且氧化石墨烯的基因毒性大于其他納米材料。Qiao等進一步對不同材料的毒性作用進行了濃度測試，發(fā)現(xiàn)石墨烯在1 μg/mL時就能引起DNA損傷，而納米顆粒二氧化硅、氧化鋅、二氧化鈦、錫和碳納米管僅在高濃度(100 μg/mL)才會引起DNA損傷，因此推測石墨烯能引起嚴重的基因毒性。Akhavan等[17]研究了石墨烯的大小和濃度對人骨髓間充質(zhì)干細胞DNA的影響，發(fā)現(xiàn)平均橫向尺寸為(3.8±0.4)μm的石墨烯在100 μg/mL濃度時出現(xiàn)DNA毒性，同時發(fā)現(xiàn)在0.1 μg/mL和1 μg/mL低濃度時，平均橫向尺寸為(11±4)nm的石墨烯能夠滲透到骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞核，并引起DNA碎裂、染色體畸變。所以GBMs對細胞核的基因毒性與材料的尺寸及濃度有關。

細胞骨架是指真核細胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系(由微管、微絲及中間纖維組成)，通常也被認為是廣義上細胞器的一種。GBMs內(nèi)化后可以損傷細胞骨架結(jié)構，破壞細胞功能。Matesanz等[28]研究顯示，氧化石墨烯納米片位于成骨細胞Saos-2的F-肌動蛋白細絲上，在其內(nèi)化后，通過細胞骨架依賴的方式影響細胞周期，造成細胞死亡。Zhou等[20]觀察了氧化石墨烯對細胞骨架動力學的影響，將乳腺癌細胞MDA-MB-231暴露于氧化石墨烯中，導致F-肌動蛋白細胞骨架的破壞，從而減弱細胞遷移。因此，GBMs可以通過直接和間接機制影響細胞骨架。

6 展望

近年來，GBMs憑借其優(yōu)良的理化性質(zhì)在生物成像、癌癥診斷、基因傳遞和藥物載體等生物醫(yī)學領域顯示出良好的應用前景，但是其潛在的健康風險不容忽視，GBMs與細胞膜的相互作用與GBMs的濃度、比表面積、形狀密切相關。通過對GBMs表面進行功能化、減少其粒徑大小等措施可以提高GBMs的運輸效率，減少其不良作用。

GBMs的細胞毒性與其內(nèi)化及在細胞的定位有關，但目前這方面的的研究甚少，有待進一步探究。盡管可以通過控制GBMs的大小，形狀和表面化學修飾來提高GBMs的生物相容性，但其細胞毒作用仍有許多問題值得探究，例如：①雖然已有大量研究表明GBMs能夠通過內(nèi)吞作用進入細胞，但是進入細胞乃至細胞器的具體通路以及其最終代謝命運并不清楚，生物體對GBMs的代謝或改變而產(chǎn)生的作用并不確定，有必要對其內(nèi)吞轉(zhuǎn)移機制及信號轉(zhuǎn)導機制進一步研究。②在毒性方面只有經(jīng)過大批量的篩選才能確定納米毒性的整體水平，單單局限于幾種細胞是遠遠不夠的。③關于GBMs的生物毒性作用的研究主要集中在體外細胞培養(yǎng)階段，然而體外研究易受培養(yǎng)環(huán)境影響，無法真實反映對體內(nèi)細胞的毒性作用，而對于體內(nèi)毒性研究還需考慮經(jīng)濟與倫理方面的問題，因此希望在將來能夠開發(fā)可以替代活體試驗的檢測手段。④關于GBMs對溶酶體、線粒體、細胞核及其他細胞器(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等)相互作用影響的研究相對較少，因此亟需展開此方面的研究工作。⑤有必要進一步拓展流式細胞儀等高通量篩選技術與基于細胞毒性機制的實驗方法相結(jié)合，有助于建立多樣化的理化參數(shù)與細胞毒性的關系模型。總之，除了從細胞水平上研究GBMs的生物安全性，還需結(jié)合分子、組織、器官及整體動物水平深入研究GBMs與生物之間的相互作用機制，為其在生物醫(yī)學等領域的安全應用提供理論依據(jù)和科學指導。