肺炎鏈球菌菌毛蛋白的結(jié)構(gòu)功能研究

顏?zhàn)右?綜述，崔亞利,2，張 靜，郭思琪，顏靈逸，趙 雪，江詠梅,2△ 審校

(1.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都 610041；2.婦兒疾病與出生缺陷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是上呼吸道常見的定植菌，菌體在突破機(jī)體免疫防御后，可引起肺炎、中耳炎、腦膜炎、敗血癥等局部或全身性感染，于5歲以下兒童和老年人群中有很高的發(fā)病率和病死率[1-2]。WHO將肺炎列為5歲以下兒童死亡的首要原因[3]，而兒童超過50%的重癥肺炎由S.pn引起，并且在死亡病例中占有更高比例[4]。

菌毛作為S.pn重要的蛋白疫苗候選因子，可通過增強(qiáng)對(duì)宿主細(xì)胞的黏附、識(shí)別細(xì)胞外基質(zhì)、參與生物膜形成等方式，介導(dǎo)細(xì)菌黏附于宿主細(xì)胞表面，也具有侵襲作用，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎性反應(yīng)[5]，進(jìn)而在宿主組織定植和致病過程中發(fā)揮重要作用[6-7]，同時(shí)，在S.pn感染的患者血清中，也可檢測(cè)到抗菌毛蛋白抗體[8]。目前，已有學(xué)者對(duì)S.pn菌毛蛋白開展相關(guān)研究，并取得了階段性成果，但相關(guān)報(bào)道較為零散，缺乏系統(tǒng)性。本文將圍繞近年來S.pn菌毛蛋白的分型、結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能的研究成果，并結(jié)合其作為蛋白抗原的免疫保護(hù)效果進(jìn)行綜述，旨在為后續(xù)研究提供更多思考方向。

1 S.pn菌毛蛋白的分型及結(jié)構(gòu)特征

與其他革蘭陽(yáng)性細(xì)菌相似，S.pn菌毛為多個(gè)菌毛蛋白亞基共價(jià)裝配形成的聚合體，每個(gè)菌毛蛋白亞基均含有分選酶(sortase，Srt)特異性LPXTG樣基序，在特定的分選酶催化下，蛋白亞基間發(fā)生共價(jià)聚合，并將菌毛結(jié)構(gòu)錨定在細(xì)胞壁表面的肽聚糖上[9]。

編碼S.pn菌毛的基因以基因島的形式存在，根據(jù)菌毛基因島和蛋白亞基結(jié)構(gòu)的不同，目前共發(fā)現(xiàn)兩種類型的S.pn菌毛，Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛，前者由菌毛基因島(pilus islet，PI)-1編碼，是蛋白亞基RrgA、RrgB和RrgC形成的聚合體；后者由PI-2編碼，是蛋白亞基PitB的聚合體。由于PI具有可移動(dòng)遺傳元件特征，S.pn菌株可同時(shí)表達(dá)兩種菌毛、僅表達(dá)一種菌毛或不表達(dá)菌毛。

1.1 Ⅰ型菌毛結(jié)構(gòu)特征

Ⅰ型菌毛是S.pn中發(fā)現(xiàn)最早的菌毛，也是表達(dá)最廣的一類，流行率約為30%[10-11]。S.pn中編碼Ⅰ型菌毛的PI-1共包括7個(gè)基因，分別是正向調(diào)節(jié)基因rlrA、表面結(jié)構(gòu)蛋白亞基基因rrgA、rrgB、rrgC和分選酶基因srtC-1、srtC-2、srtC-3(曾被稱為srtB,srtC,srtD)。其中，rrgA、rrgB、rrgC可編碼LPXTG樣基序(rrgA:YPRTG；rrgB:IPQTG；rrgC:VPDTG)，供分選酶識(shí)別催化亞基間的共價(jià)聚合，并將菌毛蛋白錨定到細(xì)胞壁表面[12]。

Ⅰ型菌毛遍布S.pn菌體表面，電鏡下直徑為2～6 nm[13]，長(zhǎng)度可超過1.5 μm[14]，呈柔韌毛發(fā)樣，直接與細(xì)胞壁表面肽聚糖連接。Ⅰ型菌毛主要由rrgA、rrgB和rrgC構(gòu)成，其中RrgA和RrgC為輔助蛋白，RrgB是主要的骨架蛋白。RrgB共包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域，空間構(gòu)型呈鼻樣凸起，具有極性；蛋白亞基首尾連接組成蛋白原絲，2條蛋白原絲相互纏繞，構(gòu)成S.pnⅠ型菌毛的主體結(jié)構(gòu)[15]。由于PI-1的序列變異性，目前發(fā)現(xiàn)有3種亞型(RrgB cladeⅠ、RrgB cladeⅡ、RrgB cladeⅢ)，不同亞型的蛋白同源性為48%～60%，不同菌株的相同亞型之間蛋白同源性大于99%[16]，相同亞型間序列高度保守。

RrgA主要分布在Ⅰ型菌毛遠(yuǎn)側(cè)端，成簇排列，為菌毛頂端蛋白，屬于黏附分子，介導(dǎo)菌毛的黏附功能，可與膠原蛋白、纖維連接蛋白和層黏連蛋白等連接。與其他革蘭陽(yáng)性細(xì)菌相似，頂端蛋白R(shí)rgA不是S.pnⅠ型菌毛初始生成所必需的。RrgA蛋白包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括1個(gè)整合素Ⅰ膠原識(shí)別結(jié)構(gòu)域，這一區(qū)域由2條插入的“胳膊”折疊為1個(gè)帶正電的搖籃結(jié)構(gòu)，以及3個(gè)莖形成結(jié)構(gòu)域組成[17]。由于PI-1中編碼RrgA cladeⅠ與clade Ⅲ 同源性大于99%，RrgA僅分為兩種亞型；且兩種亞型間的變異主要集中在蛋白頭部，細(xì)長(zhǎng)的莖部仍然保守[18]。RrgC主要分布在S.pnⅠ型菌毛近菌體端，呈單個(gè)蛋白排列，包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，由2個(gè)異肽鍵連接，結(jié)構(gòu)呈彎曲桿狀。在亞基的聚合過程中，RrgC不依賴PI-1編碼的分選酶，而是由管家分選酶SrtA催化，將S.pnⅠ型菌毛錨定在菌體表面[19]。與RrgA和RrgB不同，S.pn菌株中RrgC蛋白亞基高度同源(>98%)。

1.2 Ⅱ型菌毛結(jié)構(gòu)特征

編碼S.pnⅡ型菌毛的PI-2共包括5個(gè)基因，分別是信號(hào)肽樣蛋白基因sipA、結(jié)構(gòu)蛋白基因pitA,pitB和分選酶基因srtG1、srtG2，整個(gè)基因島位于蛋白酶T基因(PepT)和亞鐵螯合酶基因(HemH)之間[20-21]。近年來，S.pnⅡ型菌毛流行率增加，約為20%，主要與血清1型,2型,7F型,19A型和19F型相關(guān)[22]。Ⅱ型菌毛主要由結(jié)構(gòu)蛋白PitB的重復(fù)單元組成，其共價(jià)聚合由同源分選酶SrtG1和信號(hào)肽樣蛋白基因SipA催化。PitB包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域，不同分子間的D1-D2結(jié)構(gòu)域表達(dá)VTPTG基序，由SrtG1識(shí)別并首尾連接，而PitA和SrtG2并不是Ⅱ型菌毛形成所必須的[20]。作為新發(fā)現(xiàn)的S.pn菌毛類型，目前對(duì)S.pnⅡ型菌毛結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)研究尚不深入。

2 S.pn菌毛的生物學(xué)功能

菌毛雖不是S.pn生存的必需結(jié)構(gòu)，但作為介導(dǎo)菌體黏附宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和毒力因子，在S.pn侵襲性感染的初始階段發(fā)揮重要作用。

局部侵襲性感染是造成菌血癥的基礎(chǔ)，針對(duì)S.pn的呼吸系統(tǒng)感染，在S.pnⅠ型菌毛的黏附功能研究中，NELSON等[23]使用人肺泡上皮A549細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)敲除rrgA的菌體，雖然形成菌毛結(jié)構(gòu)，但黏附能力明顯降低；敲除rrgB和rrgC的菌體，雖未形成菌毛結(jié)構(gòu)，但黏附能力與野生菌毛型相似。這一發(fā)現(xiàn)表明S.pnⅠ型菌毛的黏附功能由RrgA介導(dǎo)，而非菌毛主鏈。后續(xù)NELSON等[23]在對(duì)S.pnⅠ型菌毛免疫機(jī)制的初步探究中發(fā)現(xiàn)，與無菌毛株相比，菌毛株不僅在定植、致病和引發(fā)敗血癥方面更具優(yōu)勢(shì)，還能有效誘發(fā)腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素6(IL-6)的釋放，提升宿主的炎性反應(yīng)水平。在S.pnⅠ型菌毛蛋白亞基RrgA與宿主免疫損害機(jī)制的研究中，ORRSKOG等[24]分別使用敲除和未敲除rrgA的菌株，通過鼻內(nèi)和腹腔攻毒實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)RrgA的菌株在野生型小鼠中，比使用補(bǔ)體受體3(CR3)抗體和CR3缺陷鼠更早出現(xiàn)敗血癥并有更快速的疾病進(jìn)展，表明RrgA可通過與CR3的相互作用，影響巨噬細(xì)胞功能和全身感染狀態(tài)，RrgA-CR3介導(dǎo)的吞噬作用可促進(jìn)局部感染向全身性感染擴(kuò)散。同時(shí)，BASSET等[25]的研究表明，RrgA可通過活化Toll樣受體2(TLR2)，增強(qiáng)菌株的毒力和宿主的炎癥反應(yīng)。

S.pn引起的呼吸系統(tǒng)以外的感染，多由病原菌呼吸道侵襲后形成的菌血癥發(fā)展而來。針對(duì)S.pn所致的腦膜感染，IOVINO等[26]通過靜脈攻毒實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菌毛株與無菌毛株相比，在腦中具有更高的菌體載量；當(dāng)rrgA敲除后，菌毛株在腦中的載量下降。同時(shí)，表達(dá)RrgA的菌株更易分散形成單一球菌，對(duì)菌體通過血腦屏障起到促進(jìn)作用。通過對(duì)黏附配體的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RrgA可與血腦屏障上皮細(xì)胞表面的聚合免疫球蛋白受體(pIgR)和血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(PECAM-1)結(jié)合[27]，這兩種受體的下調(diào)具有預(yù)防S.pn腦膜炎的潛力。

針對(duì)S.pn所致的中耳感染，F(xiàn)IGUEIRA等[28]通過鼻腔攻毒制造中耳感染模型，并分析中耳液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然S.pnⅠ型菌毛并非S.pn感染中耳的必要因素，但菌毛株與無菌毛株相比，有著更高的菌體載量，提示S.pnⅠ型菌毛對(duì)中耳感染也具有促進(jìn)作用。以上研究表明，S.pnⅠ型菌毛在細(xì)菌黏附、侵襲性感染與宿主免疫損傷，以及感染灶轉(zhuǎn)移中均起到重要作用，RrgA蛋白亞基是其主要黏附因子和免疫介導(dǎo)因子。上述研究均表明，S.pnⅠ型菌毛的主要功能蛋白為RrgA,主要骨架蛋白為RrgB，S.pnⅠ型菌毛不僅具有黏附功能，還具有毒力作用，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生更嚴(yán)重的炎癥損傷，在宿主局部性和全身性免疫應(yīng)答中起重要作用。

與S.pnⅠ型菌毛不同，BAGNOLI等[20]通過對(duì)A549細(xì)胞的黏附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，S.pnⅡ型菌毛通過PitB蛋白亞基和主鏈的結(jié)構(gòu)構(gòu)型，由骨架蛋白本身產(chǎn)生黏附效應(yīng)，其黏附能力弱于RrgA。膠原蛋白、纖維連接蛋白和層黏連蛋白是S.pnⅠ型菌毛和S.pnⅡ型菌毛共同的黏附配體。綜上所述，S.pn菌毛具有介導(dǎo)菌體黏附、組織定植、屏障侵襲，誘導(dǎo)機(jī)體炎癥損傷等功能，在感染過程中發(fā)揮重要作用。

3 S.pn菌毛蛋白作為疫苗候選蛋白的潛力

目前，傳統(tǒng)的S.pn多糖疫苗(pneumococcal polysaccharide vaccine,PPV)和結(jié)合疫苗(pneumococcal conjugate vaccine,PCV)已在部分國(guó)家和地區(qū)納為計(jì)劃免疫范圍。但由于幼兒免疫系統(tǒng)發(fā)育未完全成熟，PPV所使用的多糖抗原不能在2歲以下兒童中產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)[29]；PCV雖能引起有效的免疫應(yīng)答，但覆蓋血清型有限，且制造成本高，價(jià)格昂貴。有文獻(xiàn)報(bào)道[30]，在計(jì)劃免疫PCV7后，人群S.pn患病率未出現(xiàn)明顯改變，而在S.pn流行株中非疫苗型菌株比例逐漸增加。此結(jié)果提示，在大規(guī)模使用血清型依賴疫苗后，S.pn流行株出現(xiàn)了血清型置換，降低了疫苗對(duì)人群的保護(hù)效果。

大量研究表明，多種S.pn毒力因子可作為新型蛋白疫苗的候選抗原，為S.pn感染提供廣譜的保護(hù)效果，如膽堿結(jié)合蛋白(choline-binding protein,CBPs)、S.pn表面蛋白A和C(pneumococcal surface protein,PspA/PspC)、S.pn熱休克蛋白(heat shock proteins,Hsp40/DnaJ)、S.pn表面黏附素(pneumococcal surface adhesin A,PsaA)及溶血素(pneumolysin,Ply)等[31-36]。然而，目前還沒有商品化的蛋白疫苗能夠100% 抵抗S.pn感染，繼續(xù)尋找新的蛋白抗原位點(diǎn)不僅能有效促進(jìn)蛋白疫苗的發(fā)展，還能通過免疫保護(hù)機(jī)制的研究，為藥物作用靶點(diǎn)及保護(hù)效果更好的疫苗研發(fā)提供理論依據(jù)。

有研究表明，在傳統(tǒng)S.pn疫苗免疫人群的初始階段，由于疫苗型菌株的迅速減少，S.pnⅠ型菌毛在流行株中的表達(dá)短時(shí)間內(nèi)急劇下降；但隨后S.pnⅠ型菌毛的表達(dá)呈逐年上升態(tài)勢(shì)，甚至超過傳統(tǒng)疫苗普及前水平[37]，特別是在疫苗型菌株和耐藥型菌株中，說明S.pn的PI具有可移動(dòng)遺傳元件特征，S.pnⅠ型菌毛對(duì)流行株的致病力和抵抗力有重要作用，可作為蛋白疫苗發(fā)展的候選抗原靶位進(jìn)行深入研究。

現(xiàn)階段S.pn菌毛蛋白疫苗的初步研究也主要針對(duì)S.pnⅠ型菌毛，其細(xì)小絲狀的結(jié)構(gòu)，可以很好地暴露在宿主免疫系統(tǒng)之下。GIANFALDONI等[38]使用重組S.pnⅠ型菌毛蛋白，評(píng)估免疫不同蛋白后，對(duì)避免小鼠發(fā)生S.pn菌血癥的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)RrgA、RrgB和RrgC均可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，其中RrgA和RrgB具有免疫保護(hù)作用，可明顯延長(zhǎng)受致死性S.pn劑量攻擊小鼠的生存時(shí)間，而單一RrgC抗原蛋白免疫小鼠的保護(hù)作用欠佳。有研究發(fā)現(xiàn)，RrgA的兩種亞型之間存在交叉免疫，RrgA clade Ⅱ型抗原免疫可保護(hù)小鼠免受RrgA clade Ⅰ型菌株的致死劑量攻擊[18,39]，表明RrgA不僅具有免疫原性，還具有很好的保守性，是理想的菌毛疫苗候選蛋白。但RrgB的3種亞型之間無法形成交叉保護(hù)效果，針對(duì)RrgB的這一問題，研究人員使用S.pn TIGR4(RrgB cladeⅠ),S.pn 6BSPEC(RrgB cladeⅡ)和S.pn 35BSME15(RrgB cladeⅢ)的rrgB基因，構(gòu)建出包含3種RrgB亞型的融合蛋白R(shí)rgB321，不同亞型的亞基之間使用Gly-Ser-Gly- Gly-Gly-Gly連接，使融合蛋白能夠正常折疊。新構(gòu)建的融合蛋白抗原RrgB321在主動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)和被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)中，對(duì)避免小鼠產(chǎn)生S.pn菌血癥具有較好的保護(hù)效果，其中在菌毛菌株中的抗血清介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴性細(xì)菌吞噬作用水平與PCV7相當(dāng)，表明RrgB321組分疫苗能成功形成針對(duì)S.pnⅠ型菌毛菌株的免疫保護(hù)作用，可覆蓋總體S.pn菌株的30%以上。

目前，諾華公司研發(fā)的RrgB融合蛋白疫苗正處于臨床前研究中[39]，通過鼻內(nèi)黏膜免疫的途徑，可在小鼠實(shí)驗(yàn)性S.pn中耳炎的病程初期降低中耳液中菌體載量。而菌毛蛋白疫苗由于抗原靶位的限制，僅針對(duì)菌毛株產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，無法避免無菌毛株對(duì)宿主的侵襲性感染；在有菌毛蛋白抗體的環(huán)境中，菌體也可選擇性不表達(dá)菌毛，逃避免疫攻擊。為突破菌毛蛋白這一局限性，在進(jìn)一步研究中，可與菌體保守蛋白聯(lián)合制備多價(jià)疫苗，加強(qiáng)疫苗的免疫覆蓋范圍。例如，在S.pn膽堿結(jié)合蛋白A(PcpA)、S.pn組氨酸三聚體蛋白D(PhtD)、S.pn溶血素(dPly)組成的三聯(lián)蛋白疫苗和由流感嗜血桿菌蛋白D、dPly、PhtD組成的三聯(lián)蛋白疫苗已進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn)的階段[40]，可將菌毛蛋白與這些較為成熟的蛋白疫苗組分進(jìn)行配伍，發(fā)揮菌體蛋白保守性高和菌毛蛋白易被免疫系統(tǒng)識(shí)別的雙重優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，不同的免疫劑量、免疫途徑和免疫佐劑也可極大地影響菌毛蛋白疫苗的免疫效果，調(diào)整聯(lián)合疫苗不同抗原間蛋白配伍比例，嘗試多種免疫途徑，選用新型免疫佐劑，可使菌毛蛋白疫苗達(dá)到更好的保護(hù)效果[41]。

4 展 望

時(shí)至今日，人們對(duì)S.pn菌毛結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的研究已經(jīng)逐漸深入，但對(duì)其作為蛋白疫苗的保護(hù)作用及發(fā)揮作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。在PPV和PCV普及之后，面對(duì)S.pn出現(xiàn)的流行株變換、菌毛表達(dá)反彈等趨勢(shì)，人們對(duì)S.pn疫苗將抱有更多期待。菌毛不僅在S.pn致病過程中起到重要作用，同時(shí)在生物學(xué)功能、免疫原性、胞外表達(dá)、誘導(dǎo)抗體生成等方面均符合疫苗候選蛋白的選擇指標(biāo)，在疫苗設(shè)計(jì)與研發(fā)中具有很大潛力。然而，對(duì)重組S.pn菌毛蛋白疫苗的保護(hù)效果評(píng)估，大多還處于單一組分、單一模型階段，缺乏同其他黏附蛋白或互補(bǔ)蛋白的聯(lián)合評(píng)價(jià)，以及多器官、與病毒共感染模型的構(gòu)建。繼續(xù)尋找新的蛋白抗原靶位，評(píng)估新的蛋白疫苗聯(lián)合模式，仍將是S.pn蛋白疫苗的發(fā)展方向。