耿介，王超男，李少華，丁紅梅，李慧，黃皚雪，李潔，李達(dá)，白琛俊，張?zhí)?，董潔，邵寧?/p>

軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850

人vasorin（VASN）蛋白又稱slit-like2（SLITL2）蛋白，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，其N端胞外結(jié)構(gòu)域可以被去整合素-金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloprotease 17，ADAM17）酶解為可溶性VASN（soluble VASN，sVASN），釋放至體液中[1]。已有文獻(xiàn)報道，人VASN蛋白在主動脈的血管平滑肌細(xì)胞有較高水平的表達(dá)，在腎臟、胎盤組織也有表達(dá)，并且在乳腺癌細(xì)胞、肝癌組織及細(xì)胞中也有高表達(dá)[2]。

關(guān)于VASN蛋白的生物學(xué)功能已有報道，TGF-β能夠與可溶性VASN蛋白結(jié)合，抑制TGF-β介導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchy?mal transition，EMT），提示VASN蛋白可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。而我們實驗室的前期工作提示VASN蛋白可能是潛在的肝癌血清標(biāo)志物[4]，并且對VASN蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步探討。細(xì)胞中VASN蛋白有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和遷移的作用[4]；而VASN蛋白存在于HepG2細(xì)胞來源的外泌體中，其可被轉(zhuǎn)運至人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（hu?man umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中，對HUVEC的遷移也有促進(jìn)作用[5]。基于以上結(jié)果，深入探討VASN蛋白的生物學(xué)功能及其分子機制，對于研究腫瘤的發(fā)生機制非常有意義。因此，我們擬構(gòu)建VASN基因穩(wěn)定敲除的細(xì)胞株，為深入研究VASN蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

我們利用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9，將潮霉素B的抗性基因插入VASN基因，從而破壞了VASN的讀框，使VASN蛋白的表達(dá)發(fā)生異常；然后再利用潮霉素B抗性篩選獲得穩(wěn)定敲除VASN的HepG2細(xì)胞株；進(jìn)而，利用穩(wěn)定敲除VASN的HepG2細(xì)胞株研究VASN的生物學(xué)功能和分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2細(xì)胞由本室保存；表達(dá)載體pCas-guide和pSilencer2.1-U6hygro由軍事醫(yī)學(xué)研究院鄭曉飛教授惠贈；pBackZero-T載體、平末端PCR產(chǎn)物加A試劑盒購自TaKaRa公司；pfu酶購自北京全式金生物技術(shù)公司；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、T4DNA連接酶、柱式基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、BsmBⅠ購自Thermo Scientific公司；PRIME jet轉(zhuǎn)染試劑購自PolyPlus公司；潮霉素B購自羅氏公司；VASN抗體由本室自行制備；引物由生工生物技術(shù)公司合成；CCK-8購自碧云天生物技術(shù)有限公司；2×SYBR PCR Mix（ROX）購自康為公司；TRIzol試劑購自Sigma公司。

1.2 構(gòu)建pCas-gRNA質(zhì)粒

運用Crispr Design程序（http://crispr.mit.edu/）設(shè)計針對VASN基因序列的指導(dǎo) RNA（guide RNA，gRNA）的3對引物序列（表1），送生工公司合成。gRNA引物退火，用BamHⅠ和BsmBⅠ雙酶切，將酶切的退火產(chǎn)物與具有相同粘性末端的載體pCas-guide連接，20℃連接4 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，于含氨芐西林的LB培養(yǎng)板上于37℃過夜培養(yǎng)，挑取細(xì)菌單克隆PCR鑒定，分別選取2個陽性克隆測序。

1.3 構(gòu)建供體DNA質(zhì)粒pBackZero-T-VASN

收集HepG2細(xì)胞，按照基因組提取試劑盒說明書提取HepG2細(xì)胞基因組；以提取的細(xì)胞基因組作為PCR模板，分別以VASN-LF/VASN-LR、VASN-RF/VASN-RR為引物，擴增VASN左、右同?源臂片段VASN-L和VASN-R；以Hy-F/Hy-R為引物，質(zhì)粒pSilencer2.1-U6hygro為模板，擴增潮霉素B抗性基因片段Hy；將片段VASN-L、Hy和VASNR混合作為模板，以VASN-LF和VASN-RR為引物進(jìn)行重疊PCR，擴增目的片段VASN-KO；用平末端PCR產(chǎn)物加A將單個堿基A加在VASN-KO片段末端，進(jìn)而與pBackZero-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取細(xì)菌單克隆PCR鑒定，選取4個陽性克隆測序。

表1 合成的引物序列

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及VASN穩(wěn)定敲除細(xì)胞株篩選

將HepG2細(xì)胞以1×105/mL接種于6孔細(xì)胞板中，當(dāng)細(xì)胞生長至約40%時轉(zhuǎn)染1 μg pCasgRNA質(zhì)粒，48 h后再轉(zhuǎn)染1.5 μg pBackZero-TVASN質(zhì)粒；約5 d后，將轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞以6×104/mL的密度接種到100 mm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞完全貼壁后加入潮霉素B（300 μg/mL）進(jìn)行抗性篩選，2～3 d換液一次；培養(yǎng)至第10 d在顯微鏡下觀察細(xì)胞培養(yǎng)皿，可以看到已有單克隆形成，將其轉(zhuǎn)移至6孔板中繼續(xù)擴大培養(yǎng)。

無限稀釋法篩選VASN穩(wěn)定敲除的HepG2單克隆細(xì)胞株。胰酶消化細(xì)胞，以新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度為10/mL，將稀釋的細(xì)胞懸液接種至96孔板，100 μL/孔，培養(yǎng)1周后顯微鏡下觀察，選取單克隆細(xì)胞擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)至24孔板時，培養(yǎng)基中加入300 μg/mL潮霉素B繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 Western印跡檢測VASN敲除細(xì)胞株中的VASN蛋白含量

用含潮霉素B的培養(yǎng)基培養(yǎng)1周，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白，每泳道40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，Western印跡鑒定，一抗為本室自制的鼠源VASN抗體（終濃度1 μg/mL），4℃孵育整夜，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG,室溫孵育約1 h，ECL顯影。

1.6 RT-PCR檢測VASN敲除細(xì)胞株中VASN mRNA水平

用含潮霉素B的培養(yǎng)基培養(yǎng)1周，收集細(xì)胞，TRIzol提取細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA，以O(shè)ligo dT為引物，用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。20 μL體系中，以1 μL cDNA為模板，VASN-F/ VASN-R為引物進(jìn)行RT-PCR實驗，檢測VASNmRNA表達(dá)水平。

1.7 細(xì)胞增殖實驗

細(xì)胞生長曲線可以直觀地反映細(xì)胞的增殖能力。胰酶消化對數(shù)生長期的VASN穩(wěn)定敲除的細(xì)胞和野生型HepG2細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至104/mL，按100 μL/孔種于96孔板。細(xì)胞貼壁時記為零點，分別在0、24、48、72、96 h時加入10 μL CCK-8試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，測定不同時間點的D450nm值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.8 Tranwell細(xì)胞遷移實驗

將VASN穩(wěn)定敲除的HepG2細(xì)胞和野生型HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化，收集細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至2×105/mL；取200 μL細(xì)胞懸液種于Transwell小室的上層，小室下層加入500 μL新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；用棉簽擦去Transwell小室上層內(nèi)側(cè)細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色，室溫放置30 min；將多余的結(jié)晶紫沖洗干凈，顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照；用30%的醋酸酒精洗脫穿膜的細(xì)胞，測定D450nm值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

用SAS軟件分析數(shù)據(jù)，采用Student'st檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建pCas-gRNA質(zhì)粒

用Crispr Design程序設(shè)計gRNA，將靶位點序列設(shè)定在VASN編碼基因起始位點后200～400 bp。為了降低脫靶的可能，共選取了3條gRNA序列。將合成的3對DNA片段分別退火形成雙鏈，進(jìn)而雙酶切，然后與具有相同粘性末端的pCAS-guide載體連接，獲得重組質(zhì)粒pCAS-gRNA。重組子分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，LB平板培養(yǎng)，氨芐西林抗性篩選，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR，鑒定為陽性的克隆測序（圖1），結(jié)果表明3個pCAS-gRNA質(zhì)粒均構(gòu)建成功。

2.2 構(gòu)建供體DNA質(zhì)粒pBackZero-T-VASN

以HepG2細(xì)胞基因組為模板，分別以VASNLF/VASN-LR、VASN-RF/VASN-RR為引物，擴增VASN左、右同源臂片段VASN-L和VASN-R；以Hy-F/Hy-R為引物，質(zhì)粒pSilencer2.1-U6hygro為模板，擴增潮霉素B抗性基因片段Hy（約1100 bp）（圖2A）。將片段VASN-L、Hy和VASN-R混合作為模板，以VASN-LF和VASN-RR為引物擴增VASN同源臂供體DNA片段VASN-KO（圖2B）。將單個堿基A添加在VASN-KO片段末端，進(jìn)而與pBackZero-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，菌落PCR鑒定為陽性的克隆測序（圖3）。序列比對結(jié)果顯示，同源臂供體質(zhì)粒pBackZero-T-VASN構(gòu)建成功。

圖3 菌液PCR鑒定陽性克隆M：DNA marker DL2000；1～8：單克??；NC：陰性對照；PC：陽性對照

2.3 基因組水平鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株

將pCas-gRNA與pBackZero-T-VASN共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，基因組發(fā)生同源重組，潮霉素B抗性基因插入VASN基因的特定位點，使VASN不能正確表達(dá)。提取轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因組DNA，以KO-F/ KO-R為引物進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示2個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因組DNA經(jīng)PCR擴增后在750 bp處出現(xiàn)目的條帶，而野生型HepG2細(xì)胞則無條帶，證明潮霉素B抗性基因正確插入VASN基因的特定位點（圖4），VASN讀框已被破壞，VASN蛋白不能表達(dá)。

圖4 基因組PCR鑒定M：DNA marker DL5000；NC：陰性對照；1、3、4：插入潮霉素B基因后片段

2.4 Western印跡鑒定VASN穩(wěn)定敲除的單克隆細(xì)胞株

用無限稀釋法篩選VASN敲除的細(xì)胞單克隆，培養(yǎng)約1周后顯微鏡下觀察，將含有單克隆細(xì)胞的孔繼續(xù)培養(yǎng)，并加入潮霉素進(jìn)行抗性篩選。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量足夠時，取出部分細(xì)胞提取總蛋白，Western免疫印跡鑒定，結(jié)果顯示1～5號克隆的VASN蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)，1、4號最為顯著（圖5）。

2.5 RT-PCR鑒定VASN穩(wěn)定敲除的單克隆細(xì)胞株

經(jīng)過Western印跡鑒定，1號（1#）和4號（4#）VASN穩(wěn)定敲除細(xì)胞中的VASN蛋白含量最低，因此將篩選出的1#、4#細(xì)胞做基因水平鑒定。收集細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR鑒定其VASNmRNA表達(dá)。1#細(xì)胞的VASNmRNA表達(dá)水平最低，只有野生型HepG2細(xì)胞（WT）的1/7（圖6），統(tǒng)計學(xué)分析表明二者有明顯差異，說明1#單克隆細(xì)胞中的VASN基因被基本敲除。

圖5 Western印跡檢測單克隆細(xì)胞株中VASN的表達(dá)

圖6 RT-PCR鑒定VASN的mRAN水平WT為野生型HepG2細(xì)胞，1#、4#為VASN穩(wěn)定敲除細(xì)胞

2.6 VASN穩(wěn)定敲除的細(xì)胞株增殖能力下降

為了驗證VASN蛋白對細(xì)胞增殖能力的影響，利用CCK-8法檢測VASN敲除細(xì)胞和野生型細(xì)胞的增殖情況。將篩選出的1#VASN敲除細(xì)胞和野生型細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以1000/孔的濃度種于96孔板，貼壁后分別于0、24、48、72、96 h加入10 μL CCK-8，37℃孵育1.5 h后測定D450nm值，得到細(xì)胞生長曲線（圖7）?？梢钥闯鲆吧虷epG2細(xì)胞的生長速度明顯高于VASN敲除細(xì)胞株，并且兩者的差距隨著時間的延長逐漸增大（P＜0.05）。此結(jié)果提示VASN蛋白可能參與細(xì)胞增殖過程。

圖7 細(xì)胞生長曲線WT為野生型HepG2細(xì)胞，1#為VASN穩(wěn)定敲除細(xì)胞

2.7 VASN穩(wěn)定敲除的細(xì)胞株遷移能力下降

細(xì)胞遷移是反應(yīng)細(xì)胞運動能力的重要指標(biāo)，而且與侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。我們利用Transwell實驗檢測了1#VASN敲除細(xì)胞和野生型HepG2細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果顯示，VASN敲除的細(xì)胞在膜上的覆蓋面積明顯小于野生型HepG2細(xì)胞（圖8）。將穿過小室的細(xì)胞用30%醋酸洗脫，酶聯(lián)儀測定D450nm值（圖9），野生型HepG2細(xì)胞穿膜的細(xì)胞數(shù)約為VASN敲除細(xì)胞的2倍，VASN敲除細(xì)胞的遷移能力明顯減弱（P＜0.05）。此結(jié)果提示VASN可能參與細(xì)胞的遷移過程。

圖8 結(jié)晶紫染色觀察細(xì)胞遷移（400×）A：野生型HepG2細(xì)胞；B：1#VASN穩(wěn)定敲除細(xì)胞

圖9 穿過Transwell小室的細(xì)胞吸光度A：野生型HepG2細(xì)胞；B：1#VASN穩(wěn)定敲除細(xì)胞

3 討論

自2004年Yuichi Ikeda等首次鑒定出VASN蛋白，迄今相關(guān)研究較少。已有報道顯示，VASN蛋白可能與機體發(fā)育、血管損傷修復(fù)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。我們的前期工作表明，VASN不僅可能是一種新型的肝癌血清標(biāo)志物，而且可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[3]。

CRISPR/Cas9是新興的基因編輯技術(shù)[6]，具有構(gòu)建簡單、剪切高效的特點[7]。向?qū)NA通過堿基互補配對，精確靶向目的基因序列，募集Cas9核酸內(nèi)切酶到達(dá)目的基因，剪切基因組DNA。細(xì)胞通過2種修復(fù)機制，即同源重組修復(fù)和非同源末端連接修復(fù)，修復(fù)斷裂的雙鏈DNA[8-9]，本研究采用了精確度相對高的同源重組修復(fù)策略[10]，并且在提供同源重組所需的同源臂的同時，將潮霉素B抗性基因及終止子插入VASN基因起始位點下游，破壞VASN基因的開放讀框，VASN蛋白不能正常表達(dá)，而抗性基因的表達(dá)為后續(xù)細(xì)胞篩選提供了便利。

在建立VASN穩(wěn)定敲除HepG2細(xì)胞株后，我們開展了VASN蛋白生物學(xué)功能的初步探索和驗證。利用CCK-8法和Transwell實驗分別對比分析了VASN穩(wěn)定敲除細(xì)胞株和野生型HepG2細(xì)胞間在增殖和遷移能力上的差異，結(jié)果顯示缺失VASN蛋白可導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移能力減弱，與已有研究結(jié)果相符，也進(jìn)一步證明VASN缺失細(xì)胞株構(gòu)建成功。這為深入闡釋VASN的生物學(xué)功能及其分子機制奠定了基礎(chǔ)。

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