肖潺潺 方向 梅凡彪 陳茂劍 曾潔 吳玲紅 利基林，3 黃天壬，3 黎遠冬，3 鄧偉，3

人類生產(chǎn)和生活產(chǎn)生的大量氮、磷能引起水體富營養(yǎng)化，當富營養(yǎng)化程度嚴重的水體遇到適合藻類生長的溫度和光照等條件時，會導致藍藻水華頻繁發(fā)生。而毒藍藻水華的爆發(fā)會分泌一種次級代謝產(chǎn)物——藻毒素，可抑制其他物種在水體中生長，以確保藻類本身的生長優(yōu)勢［1］。微囊藻毒素（microcystins，MCs）為單環(huán)七肽毒素，由90多個異構(gòu)體組成［2］，具有強致癌性，若長期飲用含MCs的水，可對人體造成傷害，甚至引起肝癌發(fā)生［3］。水體中最常見的MCs為MC-LR、MC-RR和MC-YR，其中MC-LR毒性大于MC-RR和MC-YR［4］。MCs化學性質(zhì)穩(wěn)定，自然環(huán)境下降解非常緩慢［5］。目前自來水廠傳統(tǒng)的處理工藝如沉淀、混凝、過濾、加氯并不能有效將其去除，飲用自來水的人群也有攝入微囊藻毒素危險［6］。酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的抗體與毒素存在交叉反應，可出現(xiàn)假陽性結(jié)果，對毒素類型鑒別不佳［7-8］。高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）具有良好的分離能力，可對多種微囊藻毒素進行精確地定性和定量測定［7］。但一次分離檢測多種毒素的方法報道較少，且實驗條件差別較大。本研究在以往研究的基礎上，優(yōu)化提取MCLR、MC-RR、MC-YR 3種MCs并采用HPLC同時檢測，以進一步改進和完善水樣中MCs的HPLC檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

LC-20A高效液相色譜儀購自日本島津有限公司，包括LC-20AB高壓泵、SPD-20A紫外線檢測器、CTO-20A柱溫箱，恒溫水浴鍋購自北京西城新瑞儀器廠，真空泵、SUPELCO（500mg/6mL）購自北京康林有限公司，0.45μm有機濾膜購自天津津騰實驗設備有限公司。微囊藻毒素-RR、LR標準品（純度≥97%）購自北京索萊寶科技有限公司，微囊藻毒素-YR標準品（純度≥98%）購自Alexis有限公司。甲醇和乙腈（色譜純）、三氟乙酸（tallow fatty acid，TFA）（分析純）購自南寧科利爾生物有限公司。

1.2 標準樣品配制

MC-RR、MC-LR標準儲備液：將50μg純MC-RR、MC-LR標準物質(zhì)用0.5mL甲醇溶解配制成100μg/mL標準儲備液，MC-YR儲備液10μg/mL，可在1～4℃保存6個月，將MC-RR、MC-LR、MC-YR3種標準品逐級稀釋配制成0.05μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL系列濃度標準溶液，在色譜分析條件下依次測定。

1.3 環(huán)境水樣采集與前處理

水樣采用橫式采水器采集水面下0.5 m處表層水樣，經(jīng)砂芯漏斗去除大顆粒雜質(zhì)，置于4℃避光保存。量取500 mL水樣經(jīng)0.45μm濾膜減壓過濾。胞內(nèi)MCs提取步驟：濾膜在-80℃和37℃反復凍融3次，待測。胞外MCs固相萃取步驟：依次用10mL 100%甲醇、10mL超純水活化固相萃取柱；再將過濾后的水樣流經(jīng)固相萃取柱進行富集濃縮，流速為4.0mL/min；依次用10mL超純水和20mL 20%甲醇溶液淋洗固相萃取柱；以15 mL 80%甲醇溶液（加入0.05%TFA）將固相萃取柱上的MCs洗脫收集。15mL收集液在普通恒溫水浴鍋中60℃水浴，同時緩慢吹入氮氣吹脫，蒸發(fā)濃縮吹干，-20℃冷凍避光保存，待分析。分析前溶于1mL超純水。

1.4 淋洗液、洗脫液、流動相和流動相磷酸的含量選擇

對于淋洗液濃度的選擇，用10 mL超純水淋洗經(jīng)活化處理和上樣濃縮后的小柱，分別采用10%、15%、20%、30%甲醇溶液20mL淋洗固相萃取柱，收集不同濃度的淋洗液，HPLC檢測比較其中的毒素和雜質(zhì)。對于洗脫液的濃度，本實驗在其他條件不變的情況下對比了70%、80%、90%濃度甲醇洗脫液。選擇以下4種流動相進行比較實驗：⑴0.1%磷酸水溶液-乙腈（50∶50）；⑵0.1%磷酸水溶液-乙腈（70∶30）；⑶0.1%磷酸水溶液-乙腈（67∶33）；⑷0.1%磷酸水溶液-乙腈（65：35）。對以下3種磷酸含量的流動相進行比較實驗：⑴：水溶液-乙腈（67∶33）；⑵：0.1%磷酸水溶液-乙腈（67∶33）；⑶：0.2%磷酸水溶液-乙腈（67∶33）。采用梯度洗脫方式，對比3種流動相在保留時間、分離度、響應強度方面的差異。

1.5 HPLC測定條件

色譜柱：Inersustain ODS（4.6mm×250.0mm，5μm），在238 nm波長紫外線檢測器檢測，柱溫45℃。流動相：0.1%磷酸水溶液-乙腈（67∶33），流速1.0 mL/min，梯度洗脫，進樣量20μL。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理。分別以MC-RR、MC-LR、MC-YR 3種標準樣品的色譜峰面積為因變量，標準樣品濃度為自變量進行簡單線性回歸分析并計算相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 樣品預處理的優(yōu)化

2.1.1 淋洗液的優(yōu)化本實驗采用10%、15%、20%、30%甲醇溶液20mL淋洗固相萃取柱，收集不同濃度的淋洗液，用HPLC檢測比較其中的毒素和雜質(zhì)。經(jīng)比較，20%甲醇淋洗液較合適。

2.1.2 洗脫液的優(yōu)化本實驗在其他條件不變的情況下對比70%、80%、90%濃度甲醇洗脫液，結(jié)果顯示，80%甲醇溶液為洗脫液的方案最佳。

進一步對洗脫步驟中的一些操作細節(jié)進行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連續(xù)洗脫較分批次洗脫效果更佳，但應盡量避免小柱在洗脫過程中吹干。同時，洗脫液中加入TFA對回收率有一定影響，80%甲醇溶液洗脫液中加入0.05%TFA能明顯提高毒素的回收率，特別是MCRR的回收率，而且重現(xiàn)性較好，在同一條件下平行測定6次不同洗脫液的加標回收率，結(jié)果見表1。

表1 不同洗脫液的平均加標回收率比較（n=6，%）

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相及流動方式的選擇由于MCs易溶于水和乙腈，因此選擇水-乙腈作為流動相進行實驗。結(jié)果表明，選擇0.1磷酸水溶液-乙腈（67∶33）流動相峰形好，響應值高，出峰時間快，在20min內(nèi)可較好地分離微囊藻毒素，因此選擇0.1磷酸水溶液-乙腈（67：33）。

2.2.2 流動相磷酸的含量對磷酸含量的流動相進行比較，結(jié)果表明，以水溶液-乙腈（67∶33）流動相分析MCs時保留時間較長，且MC-LR、MC-YR 2種毒素峰形和分離度均較差，加入磷酸后離子化效率明顯增高，出峰時間快，響應強度高，且峰形好。本研究采用0.1磷酸水溶液-乙腈（67：33）流動相（pH值為3），可在20 min內(nèi)分離MC-RR、MC-LR、MC-YR，保留時間分別為7.448 min、15.291 min、18.485 min，結(jié)果見圖1。

2.2.3 標準曲線方程與檢出限按照優(yōu)化后的色譜條件，以色著峰面積對標準樣品濃度求得線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)（表2）和標準曲線（圖2）。按信噪比（S/N）=3計算本方法MC-RR、MC-YR和MC-LR的檢出限（limitof detection，LOD），分別為0.037μg/L、0.056 μg/L和0.028μg/L。

圖1 MC-RR、MC-YR、MC-LR標準樣品液相色譜圖

表2 MC-RR、MC-YR、MC-LR的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

圖2 HPLC檢測MC-RR、MC-YR、MC-LR的標準曲線

2.2.4 回收率和精密度應用本方法檢測某水源水、末梢水和純水中的MCs，樣本均加入0.1μg/L的MC-RR、MC-LR、MC-YR標準樣品，經(jīng)吸附、洗脫、濃縮處理后，每個樣品在選定的色譜條件下平行測定6次，結(jié)果見表3。其中MC-RR測定結(jié)果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為5.0%～8.2%，平均回收率為80%～100%；MC-YR測定結(jié)果的RSD為6.2%～8.1%，平均回收率為80%～90%；MC-LR測定結(jié)果的RSD為5.4%～9.6%，平均回收率為93%～110%?；厥章示?0%～120%之間，滿足GB 5749-2006《生活飲用水標準檢驗方法水質(zhì)分析質(zhì)量控制》對測量準確度的要求。

表3 HPLC檢測MC-RR、MC-YR及MC-LR的精密度和回收率（n=6）

3 討論

水體富營養(yǎng)化不斷加劇可使有毒藻類大量繁殖，水體中藻毒素特別是MCs污染日益嚴重。由于傳統(tǒng)的處理工藝如沉淀、混凝、過濾、加氯均不能有效將其去除，人們可通過直接接觸、食物鏈傳遞和飲水3種途徑長期低劑量接觸，因此，探討MCs對人類健康的危害尤為必要，而對MCs進行定性和定量是先決條件之一。MCs是細胞內(nèi)毒素，在細胞內(nèi)合成，只有細胞壁破裂后才釋放出來。對其進行檢測時，特定的細胞預處理至關(guān)重要。目前報道較多的破壞細胞壁的方法是反復凍融和超聲破碎機。Ramanan等［9］研究發(fā)現(xiàn)，超聲破碎雖可釋放更多的毒素，但可引起多肽結(jié)構(gòu)斷裂而使其降解，MCs的量并不能明顯增加。所以本實驗在-80℃和37℃反復凍融3次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒總量高且省時。

對于淋洗液的選擇，甲醇濃度越低的淋洗液洗脫能力越差，其中雜質(zhì)和毒素含量亦越低［10］。如低于15%的甲醇淋洗液中只含少量色素等雜質(zhì)，保留在小柱中的雜質(zhì)勢必造成后續(xù)檢測中MCs峰被嚴重干擾。而濃度為30%的甲醇淋洗液中雜質(zhì)含量最大，色譜圖起始基線很高，但同時又有少量MC-RR、MC-YR被洗脫檢出，導致后續(xù)檢測中毒素回收率偏低。本研究發(fā)現(xiàn)20%的甲醇淋洗液較為合適。

對于洗脫液濃度的選擇，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)用濃度為90%的甲醇溶液洗脫，其洗脫收集液的色譜圖上雜質(zhì)較多，毒素峰被嚴重干擾。而70%和80%甲醇洗脫液洗脫效率較接近，70%甲醇洗脫液的回收率略高，但考慮到后續(xù)濃縮步驟70%甲醇溶液洗脫下毒素的收集液較難吹干，因為洗脫劑中水相比例增加會使蒸發(fā)濃縮過程時間增加幾倍，延長實驗周期，綜合考慮省時、低干擾以及高回收等因素，發(fā)現(xiàn)以80%甲醇溶液作為洗脫液最佳。TFA可調(diào)節(jié)pH值，促進MCs多肽質(zhì)子化，并與之形成離子對，削弱MCs多肽與硅膠表面硅醇基的相互作用力，使其更易被洗脫［10］。而且TFA的紫外背景吸收小，易揮發(fā)，也有利于減少分析干擾。所以本實驗在80%甲醇溶液洗脫液中加入0.05%TFA，結(jié)果能明顯提高毒素的回收率和減少雜質(zhì)干擾。

理論上，HPLC譜可分辨出幾十種肽的混合物，但實際上分析、分離微小差別異構(gòu)體的混合物仍非常困難，因此在分離這一類化合物時通常使用酸性流動相以提高色譜效率。比如加入磷酸調(diào)節(jié)流動相，較低的pH值可使肽中的羧酸基質(zhì)子化，增加電離效果［11］。有報道［12-13］，隨著水-乙腈流動相酸度增大，可明顯改善MCs峰形，但MC-RR出峰過早會和實際樣品中先出來的雜質(zhì)混合，而且色譜柱也有一定的耐酸限度，因此要選擇合適的酸度，既要有較好的峰形和分離度，也要對色譜柱加以保護。本實驗采用0.1磷酸水溶液-乙腈（67∶33）流動相（pH值為3），可在20 min內(nèi)分離MC-RR、MC-LR、MC-YR，保留時間分別為7.448min、15.291 min、18.485 min，在0.05～1.0μg/mL范圍內(nèi)線性良好，回收率均在80%～110%之間，RSD為5.0%～9.6%，LOD分別為0.37、0.028和0.056μg/mL，說明本法可行、有效。

本實驗采用優(yōu)化的HPLC方法同時測定水樣中MC-LR、MC-RR和MC-YR，萃取時采用20%的甲醇溶液淋洗，80%甲醇溶液（加入0.05%TFA）洗脫，能明顯提高MCs回收率，且重現(xiàn)性好。HPLC進樣分析選用0.1%磷酸水溶液-乙腈（67：33）作為流動相進行梯度洗脫，對MC-LR、MC-RR和MC-YR分離效果較好，保留時間適中。本法解決了圖譜雜質(zhì)多，目標化合物的色譜峰分離不理想的問題，同時靈敏度高，精密度、準確度滿足現(xiàn)行國內(nèi)及國際水質(zhì)檢測標準要求，對微囊藻毒素HPLC檢測技術(shù)的推廣應用具有重要參考價值。

［1］ 李科志，鄧偉，李云西，等.廣西肝癌高發(fā)區(qū)不同水源微囊藻毒素含量調(diào)查［J］.中國癌癥防治雜志，2016，8（6）：387-389，390.

［2］ Zegura B.An overview of themechanismsofmicrocystin-lrgenotoxicity and potential carcinogenicity［J］.MiniRev Med Chem，2016，16（13）：1042-1062.

［3］ Saoudi A，Brient L，Boucetta S，et al.Management of toxic cyanobacteria for drinking water production of Ain Zada Dam［J］.Environ Monit Assess，2017，189（7）：361.

［4］ Bi X，Dai W，Zhang S，et al.Effects of toxic Microcystis genotypes on natural colony formation and mechanism involved［J］.Water Sci Technol，2017，76（3-4）：885-894.

［5］ 丁新良，何恩奇，鈕偉民，等.太湖水體中微囊藻毒素-LR污染狀況調(diào)查［J］.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2012，39（17）：4375-4377.

［6］ Dziga D，Maksylewicz A，Maroszek M，et al.The biodegradation of microcystins in temperate freshwater bodies with previous cyanobacterial history［J］.Ecotoxicol Environ Saf，2017，145：420-430.

［7］ 孫睿華.微囊藻毒素的高效液相色譜測定法若干問題的探討［J］.環(huán)境與健康雜志，2015，32（5）：448-449.

［8］ Trifiro G，Barbaro E，Gambaro A，et al.Quantitative determination by screening ELISA and HPLC-MS/MS of microcystins LR，LY，LA，YR，RR，LF，LW，and nodularin in the water of Occhito lake and crops［J］.Anal Bioanal Chem，2016，408（27）：7699-7708.

［9］ Ramanan S，Tang J，Velayudhan A.Isolation and preparative purification ofmicrocystin variants［J］.JChromatogr A，2000，883（1-2）：103-112.

［10］ 龔黎明.高效液相色譜法檢測微囊藻毒素的條件優(yōu)化及應用研究［J］.資源信息與工程，2017，32（2）：178-179.

［11］ Birungi G，Li SF.Determination of cyanobacterial cyclic peptide hepatotoxins in drinking water using CE［J］.Electrophoresis，2009，30（15）：2737-2742.

［12］ 鄒康兵，向彩紅，董玉蓮，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飲用水中微囊藻毒素［J］.化學分析計量，2017，26（1）：42-46.

［13］ 李詩言，王揚，王鼎南，等.通過型固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時快速測定魚肉中7種微囊藻毒素［J］.色譜，2017，35（8）：794-800.