結核病為結核分歧桿菌引發(fā)的傳染病，幾乎可累及人體所有器官和組織，淋巴結核約占肺外結核發(fā)病率的30%[1]。由于淋巴結核發(fā)病較為隱匿，其臨床癥狀表現(xiàn)也并不明顯，臨床上易造成誤診及漏診，對患者預后造成影響。因而臨床迫切需要一種快速而準確的檢測手段，從而為淋巴結核患者制定正確的治療方案。結核蛋白芯片檢測與T細胞酶聯(lián)免疫斑點試驗(T cells enzyme linked immunospot,T-SPOT.TB)做為診斷結核病的有效方法已經(jīng)廣泛應用于臨床，對于肺結核病的診斷，這兩種方法具有特異性較強、檢測快速等優(yōu)點，但在肺外結核尤其是淋巴結核診斷中目前應用較少[2]。本文對結核蛋白芯片檢測、T-SPOT.TB試驗在淋巴結核及非結核感染患者診斷中的應用進行研究，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取安徽省胸科醫(yī)院2014年1月至2017年5月收治的患者為研究對象，簡單隨機抽取淋巴結核患者30例為研究組，同時抽取確診為非結核感染的患者30例為對照組，淋巴結核診斷以病原學或病理學標準為金標準。研究組：男性8例，女性22例 ，年齡14～75歲，平均(40.96±14.16)歲；對照組：男性11例，女性19例,年齡20～73歲，平均(36.76±12.38)歲。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

入選標準：淋巴結腫大入院，通過病原學或病理學活檢確診為淋巴結核的患者；對照組經(jīng)過影像學檢查、痰菌檢查、病原學或病理學活檢確診不患有結核病。排除標準：HIV陽性患者；入院前四周接受過抗結核治療的患者；患者在入院前及住院期間接受免疫抑制劑治療；患有其他對試驗結果有影響疾病的患者。

1.2研究方法

1.2.1蛋白芯片法南京大淵生物技術工程有限公司提供芯片和試劑，南京大淵生物技術工程有限公司生產(chǎn)PBT-X2型生物識別儀對芯片結果進行分析，操作步驟按說明書嚴格進行。采集患者靜脈血，樣品編號在蛋白芯片上標記，將患者血清100 μL滴加入蛋白芯片盒內(nèi)窗口，按操作步驟順序滴加反應試劑，在試劑反應結束后半小時內(nèi)采用PBT-X2型生物識別儀對芯片進行結果分析，PBT-X2型生物識別儀設置參數(shù)對陰性和陽性結果進行判別。判別標準：脂阿拉伯甘露聚糖，兩種分子量不同的結核分枝桿菌蛋白任一抗體檢測陽性即判別結果為陽性。

1.2.2T-SPOT.TB試驗英國Oxfordimmunotec 提供T-SPOT.TB檢測試劑盒，操作步驟按說明書嚴格進行。采集患者靜脈血，分離PBMCs，加培養(yǎng)液重懸PBMCs并孵育過夜，配制每100 μL含有25萬個細胞的標準溶液500 μL，每患者個樣本設置4個檢測孔：空白對照孔(細胞培養(yǎng)液)、抗原A檢測孔、抗原B檢測孔、陽性對照孔(植物血凝素)。每孔加入100 μL細胞終溶液，在37℃保持濕潤的含有5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育16～20 h，洗板，然后在每個反應孔加入50 μL標記抗體工作液，2～8℃孵育1 h，洗板后每個反應孔加入50 μL底物顯色溶液室溫孵育7min，離子水徹底洗滌培養(yǎng)板終止反應，通過酶聯(lián)免疫斑點系統(tǒng)采用專門的ELISPOT讀板儀斑點數(shù)量。結果判斷標準：空白對照孔斑點數(shù)為0～5個時且(抗原A或抗原B孔的斑點數(shù))減去(空白對照孔斑點數(shù))≥6；空白對照孔斑點數(shù)為6～10個時且(抗原A或抗原B孔的斑點數(shù))。

2　結果

2.1兩組試驗結果比較研究組結核蛋白芯片試驗陽性率為60.00%，T-SPOT.TB試驗陽性率為90.00%，均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1兩組患者試驗結果比較[例(%)]

試驗研究組(n=30)對照組(n=30)陽性陰性陽性陰性χ2值P值結合蛋白芯片18(60．00)12(40．00)6(20．00)24(80．00)10．0000．003T-SPOT．TB27(90．00)3(10．00)2(6．67)28(93．33)41．7100．000

2.2聯(lián)合檢測結果比較研究組聯(lián)合檢測雙陽性率為53.33%，高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；對照組聯(lián)合檢測雙陰性率為73.33%,高于研究組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2兩組患者聯(lián)合檢測結果比較[例(%)]

結果研究組(n=30)對照組(n=30)χ2值P值雙陽性16(53．33)2(6．67)13．4130．000雙陰性2(6．67)22(73．33)25．0690．000

2.3特異度、敏感度比較T-SPOT.TB試驗敏感度為90.90%，結核蛋白芯片試驗敏感度為71.42%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.383，P=0.036)。T-SPOT.TB試驗特異度為93.75%，結核蛋白芯片試驗特異度為83.33%，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.910，P=0.340)。

3　討論

結核病目前已成為我國關注的公共衛(wèi)生和社會問題[3]。淋巴結核系結核桿菌感染人體淋巴系統(tǒng)產(chǎn)生的結核病變，包括體表和深部淋巴結核，淋巴結核常見類型有頸部淋巴結核、縱隔淋巴結結核、腹內(nèi)淋巴結核等[4]。目前對于淋巴結核尚缺乏有效的診斷手段，對此類疾病的漏診率、誤診率較高。淋巴結核的診斷多需行手術活檢淋巴組織，結合病原學或者病理學才能明確診斷[5]。

目前，臨床檢測患者血清中是否存在結核分枝桿菌可采用結核蛋白芯片、T-SPOT.TB 試驗等方法[6]。結核蛋白芯片克服了結核分枝桿菌感染人體后，免疫背景及病程造成的抗原表達數(shù)量、種類不同導致的檢測特異性降低[7]。人體受結核分枝桿菌感染后T細胞受刺激而活化，T-SPOT.TB做為一種體外診斷能夠檢測活化的效應T細胞，從而診斷結核感染[8]。T-SPOT.TB對具有結核潛伏感染風險或疑似結核病的患者均適用，同時該方法能夠減少其他分枝桿菌、卡介苗接種引起的假陽性結果[9]。本研究結果表明，T-SPOT.TB試驗敏感度較高，特異度較強。

針對淋巴結核目前尚缺乏簡便、靈敏的診斷方法，結核蛋白芯片雖然可以輔助診斷結核，但其對淋巴結核陽性率較低[10]。T-SPOT.TB檢測方法已成為臨床診斷結核病較為敏感的檢測方法[11]。本研究發(fā)現(xiàn)2例假陰性患者，可能與患者受結核感染階段不同，靜脈血液采集在患者細胞免疫發(fā)生之前，患者存在腫瘤、免疫功能低下、口服免疫抑制劑等問題相關[12]。T-SPOT.TB結果僅提示患者體內(nèi)存在針對結核分枝桿菌的特異效應T細胞，不能確定其結核是否處于活動期。如果將結核蛋白芯片檢測與T-SPOT.TB聯(lián)合檢測，相互印證可能更有利于淋巴于結核的診斷。本研究顯示研究組聯(lián)合檢測雙陽性率高于對照組，對照組聯(lián)合檢測雙陰性率高于研究組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，T-SPOT.TB敏感度高于結核蛋白芯片試驗敏感度，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結核蛋白芯片聯(lián)合T-SPOT.TB檢測可以輔助診斷淋巴結核。

[1]PETO H M, PRANT R H, HARRINGTON T A, et al.Epidemiology of extrapulmonary tuberculosis in the United States, 1993-2006[J].Clin Infect Dis,2009,49(9):1350-1357.

[3]王馨. 結核菌快速培養(yǎng)法與 γ-干擾素釋放試驗在結核病診斷中的應用價值[J].安徽醫(yī)學,2015,36(5):607-609.

[4]KO J M, PARK H J, KIM C H.Clinicoradiologic evidence of pulmonary lymphatic spread in adult patients with tuberculosis[J]. Am J Roentgenol,2015,204(1):38-43.

[5]YANG J, CHEN J, YUE J,et al. Relationship between human LTA4H polymorphisms and extra-pulmonary tuberculosis in an ethnic Han Chinese population in Eastern China[J].BMC Infect Dis,2014 ,94(6):657-663.

[6]ENGIN G,ACUNAS B,ACUNAS G,et al.Imaging of extrapulmonary tuberculosis[J].Radiographics, 2000,20(2):471-488.

[7]吳友根,楊興萍,王軍,等.結核蛋白芯片檢測診斷結核病的價值[J].中國感染與化療雜志,2014,14(3):196-198.

[8]SULTAN B, BENN P, MAHUNGU T, et al.Comparison of two interferon-gamma release assays (QuantiFERON-TB Gold In-Tube and T-SPOT.TB) in testing for latent tuberculosis infection among HIV-infected adults[J].Int J STD AIDS, 2013,24(10):775-779.

[9]QIN L L, WANG Q R, WANG Q, et al.T-SPOT.TB for detection of tuberculosis infection among hematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients[J].Asian Pac J Cancer Prev, 2013,14(12):7415-7419.

[10]ZHANG T, FAN R, WANG Z,et al.Differential diagnosis between Crohn's disease and intestinal tuberculosis using integrated parameters including clinical manifestations, T-SPOT, endoscopy and CT enterography[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(10):17578-17589.

[11]WANG X, WU Y, WANG M,et al.The sensitivity of T-SPOT.TB assay in diagnosis of pediatric tuberculosis[J].Fetal Pediatr Pathol, 2014,33(2):123-125.

[12]WU X, MA Y, LI D,et al. Diagnostic value of ELISPOT technique for osteoarticular tuberculosis[J]. Clin Lab, 2014，60(11):1865-1870.