外源蛋白酶對腐乳后發(fā)酵理化和感官特性的影響

喻世哲，劉晶晶，吳佳倫，韓北忠，陳晶瑜*

腐乳習慣上分為“紅方”、“青方”、“白方”3 種，是我國傳統的發(fā)酵豆制品[1-3]，因其味道鮮美、具有抗氧化和降血壓等保健功能[4-7]深受消費者喜愛。腐乳的發(fā)酵過程主要發(fā)生了生物化學和物理化學兩種變化[8]。腐乳白坯的制作為物理化學變化[9]，腐乳的后發(fā)酵階段主要是生物化學變化。 腐乳發(fā)酵分為前發(fā)酵和后發(fā)酵[10-12]，前發(fā)酵是培養(yǎng)菌系和積累酶系的過程，一般為36～48 h。后發(fā)酵是酶系作用于腐乳毛坯的過程，時間較長，一般為3～6 個月，發(fā)酵周期長，生產成本高，制約了其在我國的工業(yè)化生產[13-14]。近年來，針對縮短腐乳生產周期的研究較多，主要集中在對后發(fā)酵進行處理。比如，加酶控溫后發(fā)酵[15-20]，添加增香酵母、乳酸菌[21]，高壓電場和高頻磁場處理[22]等。其中，在后發(fā)酵階段直接加入酶制劑是一種比較便捷的方式。本研究在腐乳后發(fā)酵階段直接添加外源蛋白酶（木瓜蛋白酶和皺胃酶），對腐乳后發(fā)酵過程中理化和感官特性的變化進行研究，了解外源蛋白酶的添加對腐乳品質的影響，結果將對酶促腐乳的工業(yè)化生產具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛霉型紅腐乳 中國北方某腐乳生產企業(yè)；皺胃酶、木瓜蛋白酶（食品級） 帝斯曼中國有限公司；甲醛、硝酸銀（均為分析純） 廣東汕頭市西隴化工廠；氫氧化鈉（分析純） 北京化工廠；鉻酸鉀（分析純） 天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

DHG-9053A電熱恒溫干燥箱、DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；BSA2202S分析天平、PB-21型pH計 德國賽多利斯公司；FTC質構儀北京盈盛恒泰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶促腐乳的制備

腐乳鹽坯尺寸為3.2 cm×3.2 cm×1.6 cm，裝于已滅菌的玻璃瓶中，每瓶12 塊，總質量約160 g。按照腐乳-湯料1∶1（g/mL）的比例，每瓶中加入160 mL湯料，然后分別加入木瓜蛋白酶和皺胃酶[23]，添加量分別為腐乳總蛋白的1%、2%、4% （質量分數），密封，于28 ℃后發(fā)酵培養(yǎng)。每個添加量的酶促腐乳制作3 個平行樣。

1.3.2 樣品采集

每個酶促腐乳樣品于后發(fā)酵5、10、15、20、25、30、35、40 d時，取3 塊用于理化分析和感官評價。

1.3.3 理化指標的測定

pH值：精確稱取樣品3.000 g，加入蒸餾水27 mL，高速勻漿后，用pH計測定懸浮液的pH值；水分含量：采用常壓恒重法，參照SB/T 10170—2007《腐乳》[24]；總酸含量：采用滴定法，參照SB/T 10170—2007；氨基態(tài)氮含量：采用甲醛滴定法，參照SB/T 10170—2007。

硬度：利用質構儀測定，具體參數：探頭型號P/0.5，測前下壓和測試速率60 mm/min，壓縮比例30%，觸發(fā)力2.5 N。

1.3.4 感官評價

采用定量描述分析進行感官評價[25]。選定11 名感官評價人員，采用5 分制，結合SB/T 10170—2007中的感官評定要求制定評分標準，如表1所示。

表1 腐乳感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of sufu

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程中樣品pH值的變化

圖1 不同添加量蛋白酶處理腐乳pH值在后發(fā)酵過程中的變化Fig. 1 Changes in pH during ripening of sufu with different concentrations of proteases

由圖1可看出，腐乳后發(fā)酵過程中pH值總體呈下降趨勢?？瞻捉M中，pH值在第5天明顯下降，之后保持穩(wěn)定，在第25天再次下降后保持平穩(wěn)，最低達到6.39。木瓜蛋白酶處理組中，pH值在0～20 d的變化趨勢與空白組基本保持一致；25 d時4%木瓜蛋白酶處理組pH值下降至6.51后保持穩(wěn)定，但是高于空白組；1%和2%木瓜蛋白酶處理組pH值均在第30天明顯下降之后略有升高，第40天時分別達到6.50、6.54。1%皺胃酶處理組的pH值在第5天下降明顯，至第25天保持下降趨勢，之后略有升高。2%和4%皺胃酶處理組的pH值在第25天之前與空白組變化趨勢基本保持一致，之后保持穩(wěn)定，但pH值始終高于空白組。Naes等[26]從乳酸菌NCDO151中提取出蛋白酶，對其加速干發(fā)酵香腸成熟作了初步研究，發(fā)現蛋白酶的添加使可溶性蛋白質快速降解，pH值迅速下降。而Diaz等[27]在發(fā)酵香腸中添加木瓜蛋白酶，結果表明外源蛋白酶的添加對發(fā)酵過程中香腸pH沒有明顯的影響。

引起腐乳在發(fā)酵過程中pH值降低的主要原因是乳酸菌等微生物發(fā)酵產生乳酸、醋酸、琥珀酸等有機酸、蛋白質分解后酸性氨基酸的釋放、碳水化合物和脂肪酸的分解。pH值升高則是由于蛋白質分解產生氨基酸，氨基酸的進一步脫氨基作用產生氨[18]。實驗組中加入木瓜蛋白酶和皺胃酶，加速腐乳中蛋白質的分解，產生了比空白組更多的游離氨基酸和氨，因此在25 d后木瓜蛋白酶組和皺胃酶組的pH值高于空白組。

2.2 發(fā)酵過程中樣品水分的變化

圖2 不同添加量蛋白酶處理腐乳水分含量在后發(fā)酵過程中的變化Fig. 2 Changes in moisture during ripening of sufu with different concentrations of proteases

由圖2可看出，腐乳后發(fā)酵過程中水分含量整體呈緩慢上升趨勢，空白組水分質量分數在第5天時下降后呈上升趨勢，達到63.2%，15～30 d呈下降趨勢后上升。木瓜蛋白酶處理組中，相比于空白組不同的是：第15天時腐乳中水分含量仍呈緩慢上升趨勢，除1%木瓜蛋白酶處理組的水分含量在第25天后逐漸降低，其余實驗組水分含量均趨于穩(wěn)定。皺胃酶處理組中，腐乳水分含量變化趨勢總體與空白組一致，其中1%皺胃酶處理組水分含量在第25天后有較大的波動。根據SB/T 10170—2007，在后期發(fā)酵結束后，成品腐乳的水分質量分數不大于72%即符合標準，木瓜蛋白酶和皺胃酶組的腐乳均符合標準。

腐乳前期發(fā)酵結束后水分質量分數為45%左右，在腐乳后發(fā)酵階段，隨著湯料中水分的遷移，其水分含量迅速上升。蛋白酶組與空白組存在差異，其主要原因是木瓜蛋白酶和皺胃酶使腐乳表面覆膜蛋白質水解為肽、氨基酸等小分子物質，增加了腐乳的滲透性，促進了水分的遷移。

2.3 發(fā)酵過程中樣品總酸的變化

由圖3可看出，腐乳后發(fā)酵中總酸含量呈上升趨勢，然后趨于穩(wěn)定。參照SB/T 10170—2007，成品紅腐乳總酸含量規(guī)定不大于1.3 g/100 g，空白組、木瓜蛋白酶處理組和皺胃酶處理組均符合標準。其中空白組中，總酸含量在后發(fā)酵階段的0～20 d迅速上升，在20～30 d時存在明顯的下降，之后呈先上升后下降的趨勢。木瓜蛋白酶處理組中，10～25 d總酸上升速率低于空白組，其中4%木瓜蛋白酶處理組總酸含量在20～25 d之間下降后緩慢上升，第40天時總酸含量到達0.59 mg/100 g左右，與空白組一致；1%和2%木瓜蛋白酶處理組均基本呈上升趨勢，而1%木瓜蛋白酶處理組在第40天時呈下降趨勢，至0.54 mg/100 g。除4%皺胃酶處理組在25～30 d時明顯上升后迅速降低以外，1%和2%皺胃酶處理組腐乳總酸含量變化趨勢基本與空白組一致，前20 d迅速上升，在20 d后緩慢下降，與董爽等[28]在研究酶促腐乳生產過程中各種理化性質變化的研究結果相符。

圖3 不同添加量蛋白酶處理腐乳總酸含量在后發(fā)酵過程中的變化Fig. 3 Changes in total acid content during ripening of sufu with different concentrations of proteases

腐乳在后發(fā)酵過程中，總酸含量上升的主要原因為：湯料的灌入使得腐乳瓶中呈缺氧狀態(tài)，產生乳酸，并且微生物大量分泌淀粉酶和脂肪酶，將腐乳中的碳水化合物和脂肪水解為有機酸和脂肪酸等物質，從而使得腐乳總酸含量上升。而后發(fā)酵過程中總酸含量的下降可能與酶促腐乳內部發(fā)生的酯化反應有關，能夠消耗部分酸性化合物[15]。

2.4 發(fā)酵過程中樣品氨基態(tài)氮的變化

由圖4可看出，腐乳后發(fā)酵過程中氨基態(tài)氮的含量總體呈上升趨勢，最后趨于平穩(wěn)。根據SB/T 10170—2007[23]，成品紅腐乳的氨基態(tài)氮含量不小于0.42 mg/100 g即符合標準，空白組、木瓜蛋白酶和皺胃酶處理組均在第15天時達到標準要求。其中空白組中腐乳的氨基態(tài)氮的含量隨著發(fā)酵的進行逐漸上升，前15 d氨基態(tài)氮含量迅速增長，15～20 d時增長緩慢后，又迅速上升，在第30天后逐漸趨于穩(wěn)定達到0.55 mg/100 g。1%和2%木瓜蛋白酶處理組氨基態(tài)氮的含量變化與空白組無明顯差異，4%木瓜蛋白酶處理組組的氨基態(tài)氮含量在整個后發(fā)酵過程中均明顯高于空白組。2%和4%皺胃酶處理組氨基態(tài)氮的含量均高于空白組，其中1%皺胃酶處理組雖然在第10天前氨基態(tài)氮含量的上升速率明顯高于空白組，但是之后基本與空白組保持一致。氨基態(tài)氮是指氨基酸形式的氮，其含量與氨基酸含量呈正比關系，因此氨基態(tài)氮的含量表明了氨基酸的含量和蛋白水解程度。結果表明，4%的木瓜蛋白酶和2%、4%的皺胃酶的添加促進了蛋白質的分解，能在一定程度上縮短腐乳生產周期。

圖4 不同添加量蛋白酶處理腐乳氨基態(tài)氮含量在后發(fā)酵過程中的變化Fig. 4 Changes in amino nitrogen content during ripening of sufu with different concentrations of proteases

2.5 發(fā)酵過程中樣品硬度的變化

圖5 不同添加量蛋白酶處理腐乳硬度在后發(fā)酵過程中的變化Fig. 5 Changes in hardness during ripening of sufu with different concentrations of proteases

由圖5可看出，腐乳后發(fā)酵過程中硬度總體呈下降趨勢，空白組0～5 d硬度迅速下降至34.11 N，之后5～15 d趨于穩(wěn)定，最后隨著后發(fā)酵的進行逐漸下降，最低達到26.04 N。1%、2%和4%木瓜蛋白酶處理組硬度下降速率均大于空白組，并且逐漸減小。其中1%和2%木瓜蛋白酶處理組硬度變化趨勢基本一致，4%的硬度下降速率最快，在發(fā)酵結束第40天時硬度達到最小值（22.87 N），明顯低于空白組。皺胃酶處理組中，各組的硬度下降速率也均大于空白組，其中4%皺胃酶處理組硬度下降速率在后發(fā)酵前20 d低于1%和2%，20 d至發(fā)酵結束期間，硬度快速下降，此時下降速率大于其他組。

腐乳的質構與腐乳的組成、結構和成熟度等密切相關，質構是評價腐乳品質的一項重要指標。利用質構指標評價腐乳質量可以避免因感官評價重現性不佳，主觀判斷帶來的一些誤差。其中硬度是指沖傳樣品時的壓力最大值[29]。結果表明，隨著各添加量木瓜蛋白酶和皺胃酶的加入，腐乳中的蛋白質在相關酶的作用下加速降解，導致硬度明顯降低。其中4%木瓜蛋白酶和4%皺胃酶組對腐乳后發(fā)酵硬度的影響最為明顯，因此，感官評價中分別選取4%的木瓜蛋白酶和皺胃酶作為實驗組。

2.6 酶促腐乳感官評價

圖6 腐乳感官評價Fig. 6 Sensory evaluation of sufu

由圖6可知，添加蛋白酶組的塊形完整度和外部顏色與空白組等均?？瞻捉M質地硬度得分為3.27 分，木瓜蛋白酶處理組和皺胃酶處理組的得分均高于空白組（分別為3.64 分和4.00 分）。并且木瓜蛋白酶組（4.18分）和皺胃酶（4.64 分）的口感得分均高于空白組（3.27 分）。以上說明添加外源蛋白酶降低了腐乳的質地硬度，這與質構分析的結果一致，并且改善了腐乳的口感細膩程度，其中皺胃酶處理組最為明顯。郭艷等[30]研究結果表明，在腐乳灌裝時加入風味蛋白酶，加酶組在后發(fā)酵14 d時已經具備了成熟腐乳的感官性狀，而空白組腐乳則在40 d時達到要求。內部顏色、主要香氣和鮮味方面，木瓜蛋白酶組與皺胃酶組得分等均，并且均高于空白組。說明添加外源蛋白酶都可以改善腐乳內部顏色，提高腐乳香氣和鮮味。可能是外源蛋白酶分解腐乳中的蛋白質分解產生呈味氨基酸和揮發(fā)性香味物質的結果，并且腐乳表面毛坯層的分解也有利于湯料的滲入，可以改善腐乳內部顏色，促進腐乳成熟。木瓜蛋白酶處理組苦味得分高于空白組和皺胃酶組（均為3.64 分），可能與木瓜蛋白酶分解腐乳中蛋白質產生苦味氨基酸等有關[31]。

3 結 論

在腐乳后發(fā)酵過程中，外源蛋白酶添加組的pH值在第25天后均高于空白組，其中1%的皺胃酶組在第40天時pH值最高（6.57）；外源蛋白酶的添加對腐乳的水分含量無明顯影響；在腐乳后發(fā)酵過程中3 組腐乳的總酸含量均呈上升趨勢，木瓜蛋白酶組在10～25 d總酸含量上升速率低于空白組，然后基本趨于一致；4%木瓜蛋白酶、2%和4%皺胃酶的添加使腐乳的氨基態(tài)氮含量增加；4%木瓜蛋白酶和4%皺胃酶的添加能夠明顯降低腐乳硬度；外源蛋白酶的添加能在一定程度上改善腐乳的口感和內部顏色，提供主要香氣和鮮味；木瓜蛋白酶添加會產生一定的苦味。

參考文獻：

[1] POYSA V, WOODRO L, YU K. Effect of soy protein subunit composition on tofu quality[J]. Food Research International, 2006,39(3): 309-317. DOI:10.1016/j.foodres.2005.08.003.

[2] FENG Z, HUANG S, AI Z W, et al. Evaluation of autochthonous micrococcus strains as starter cultures for the production of Kedong sufu[J]. Journal of Applied Microbiology, 2016, 120(3): 671-683.

[3] DENG J, WU H, ZHAO X, et al. Isolation and identification of Bacillus from spontaneous fermented sufu[J]. Advanced Materials Research, 2013, 634/635/636/637/638: 1179-1183. DOI:10.4028/www.scientific.net/AMR.634-638.1179.

[4] LIU Y, ZHOU Y, NIRASAWA S, et al. In vivo anti-fatigue activity of sufu with fortification of isoflavones[J]. Pharmacognosy Magazine,2014, 10(39): 367-373. DOI:10.4103/0973-1296.137380.

[5] 王越鵬, 胡峰, 汪建明, 等. 酶促腐乳生產過程中抗氧化的研究[J].食品與發(fā)酵科技, 2012, 48(5): 50-53. DOI:10.3969/j.issn.1674-506X.

[6] 凃婧, 李笑梅. 腐乳相關研究及開發(fā)進展[J]. 大豆科技, 2016(4): 39-44. DOI:10.3969/j.issn.1674-3547.

[7] 莊洋, 田盼盼, 單長海, 等. 腐乳的營養(yǎng)價值及其生理活性[J]. 湖北民族學院學報(自然科學版), 2016, 34(2): 179-183.

[8] 王越鵬, 胡峰, 汪建明, 等. 酶促腐乳工藝優(yōu)化的研究[J]. 中國調味品, 2013, 38(5): 68-71. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.

[9] 朱立雄, 蔡欣. 腐乳毛霉培養(yǎng)條件及工藝探討[J]. 中國釀造, 2014,33(10): 123-126. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.

[10] 李幼筠. 中國腐乳的現代研究[J]. 中國釀造, 2006, 25(1): 4-7.DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.

[11] 余若黔, 涂煜, 李杰偉, 等. 腐乳培菌期的生化變化[J]. 華南理工大學學報(自然科學版), 2001, 29(4): 49-52. DOI:10.3321/j.issn:1000-565X.

[12] 龍菊, 吳擁軍, 何映霞, 等. 高大毛霉腐乳發(fā)酵過程中主要成分的變化[J]. 食品研究與開發(fā), 2012, 33(6): 170-173. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.

[13] HAN B Z, ROMBOUTS F M, NOUT M J A. Amino acid profiles of sufu, a Chinese fermented soybean food[J]. Journal of Food Composition & Analysis, 2004, 17(6): 689-698.

[14] FENG Z, CHEN H, LV X T, et al. Accelerated ripening of Kedong sufu with autochthonous starter cultures Kocuria rosea KDF3 and its protease KP3 as adjuncts[J]. Journal of Applied Microbiology, 2014,116(4): 877-889.

[15] 董爽, 陶杰, 汪建明, 等. 酶促腐乳不同發(fā)酵時期的微觀品質變化研究[J]. 中國調味品, 2015, 5(1): 45-47. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.

[16] 張媛媛, 李立英, 汪建明. 酶促速熟過程中腐乳成分及微觀結構的分析[J]. 天津科技大學學報, 2012, 27(1): 9-13. DOI:10.3969/j.issn.1672-6510.

[17] 曹瑞博. 酶促成熟腐乳及其品質的研究[D]. 天津: 天津科技大學,2010.

[18] 周鴻翔, 陳龍, 滕鈺, 等. 酶促膏狀腐乳醬中相關酶的作用研究[J].中國調味品, 2014, 26(7): 57-61. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.

[19] 任健, 杜國軍, 欒廣忠. 外源蛋白酶對白腐乳制備過程部分性質的影響[J]. 齊齊哈爾大學學報(自然科學版), 2010, 26(2): 64-67.DOI:10.3969/j.issn.1007-984X.

[20] 滕鈺, 周鴻翔, 邱樹毅, 等. 酶促紅油腐乳后酵過程中化學組分動態(tài)變化的研究[J]. 食品科技, 2014, 39(5): 247-250.

[21] 劉會勇, 楊立蘋, 劉瑞欽, 等. 縮短腐乳發(fā)酵周期的研究[J]. 中國調味品, 2003(1): 13-14. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.

[22] 何熙, 胡飛. 高壓電場對毛霉蛋白酶活力的影響及應用于腐乳催熟[J]. 食品與生物技術學報, 2003, 22(4): 65-68. DOI:10.3321/j.issn:1673-1689.

[23] 孫君社, 魯緋, 韓北忠, 等. 論腐乳的酶法生產[J]. 中國釀造, 2002,21(6): 7-9. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.

[24] 商務部. 腐乳: SB/T 10170—2007[S]. 北京: 中國標準出版社, 2007.

[25] 趙麗華, 靳燁, 馬長偉, 等. 戊糖片球菌與復合發(fā)酵劑對羊肉干發(fā)酵香腸質地剖面分析(TPA)和色澤的影響[J]. 食品科技, 2009, 34(10):122-126.

[26] NAES H, HOLCK A L, AXELSSON L, et al. Accelerated ripening of dry fermented sausage by addition of a Lactobacillus, proteinase[J].International Journal of Food Science & Technology, 1994, 29(6): 651-659. DOI:10.1111/j.1365-2621.1994.tb02106.x.

[27] DIAZ O, FERNANDEZ M, GD G D F, et al. Proteolysis in dry fermented sausages: the effect of selected exogenous proteases[J].Meat Science, 1997, 46(1): 115-128.

[28] 董爽, 陶杰, 汪建明. 酶促腐乳生產過程中各種理化性質的變化研究[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2014, 50(5): 23-26.

[29] 周熒, 潘思軼. 腐乳發(fā)酵過程中化學組分與質構的變化[J]. 食品科學, 2011, 32(1): 70-73.

[30] 郭艷, 周鴻翔, 邱樹毅, 等. 酶促速熟腐乳發(fā)酵過程中成分變化的研究[J]. 食品科技, 2013, 38(5): 273-277.

[31] 梁洪波. 腐乳產蛋白酶菌株的篩選及多酶協同作用制備大豆多肽的研究[D]. 雅安: 四川農業(yè)大學, 2005.