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      新疆南疆規(guī)模羊場片形吸蟲的基因鑒定及分析

      2018-04-25 03:52:50徐建平胡建軍張婉琪張瑩鈺
      中國獸醫(yī)雜志 2018年12期
      關(guān)鍵詞:肝片吸蟲南疆

      王 娜, 徐建平, 胡建軍, 崔 鑫, 張婉琪, 張瑩鈺, 徐 震

      (1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)南疆動物疫病診斷與防控工程實(shí)驗室, 新疆 阿拉爾 843300 ;2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二師畜牧獸醫(yī)工作站, 新疆 庫爾勒 841000 ;3.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 新疆 阿拉爾 843300)

      片形吸蟲病是由片形吸蟲感染引起的人獸共患病。 肝片吸蟲寄生于食草哺乳動物和人的肝臟和膽管內(nèi),對肝臟造成機(jī)械性損傷,引起機(jī)體肝炎、膽管炎,導(dǎo)致全身中毒和營養(yǎng)障礙使機(jī)體發(fā)育不良甚至死亡的寄生蟲病。 片形吸蟲在我國有兩種:肝片形吸蟲(Fasciola hepatica) 和大片形吸蟲(F.gigantica),屬于片形科(Fasciolidae)。 肝片形吸蟲呈世界性分布,在我國也是分布最廣泛、危害最嚴(yán)重的寄生蟲病之一,遍及全國31 個省市自治區(qū),很多呈地區(qū)性流行;大片吸蟲主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū),在我國多見于南方諸省、區(qū)[1]。 片形吸蟲在其慢性病程中使動物瘦弱,發(fā)育障礙,乳牛產(chǎn)奶量減少,毛、肉產(chǎn)量減少和質(zhì)量下降,給畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。 人感染片形吸蟲可引起腹痛、發(fā)熱和黃疸等癥狀,嚴(yán)重者甚至危及生命。

      傳統(tǒng)的分類學(xué)主要依據(jù)片形吸蟲成蟲的形態(tài),結(jié)合生活史、流行病學(xué)等特征對蟲體進(jìn)行分類鑒定,對于形態(tài)比較規(guī)則的蟲體鑒別比較有效。 而兩種片形吸蟲形態(tài)極其相似,且片形吸蟲種內(nèi)個體差異較大,同一蟲種又因宿主的種類、宿主的反應(yīng)的不同而不同,導(dǎo)致蟲體的形態(tài)極其不規(guī)則,這就使得利用傳統(tǒng)的分類學(xué)方法對識別一些親緣種及隱藏種有一些難度。 本研究以形態(tài)學(xué)鑒定為基礎(chǔ),結(jié)合PCR 鑒定方法,從分子生物學(xué)分類角度來鑒定在形態(tài)上較難分辨其種類的片形吸蟲,為新疆片形吸蟲種類鑒定提供參考依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 病料來源 2017 年春季,新疆南疆某規(guī)模化羊場羊群中出現(xiàn)部分羊逐漸消瘦,食欲減退,被毛粗亂、易脫落,黏膜蒼白。 該養(yǎng)殖場為舍飼管理,小尾寒羊與當(dāng)?shù)仄贩N羊雜交繁殖方式。 經(jīng)對3 只極度消瘦的羊只剖檢,肝臟表面發(fā)現(xiàn)有蟲體,肝組織受損,肝臟腫大,膽管增粗。 剝離肝臟中蟲體,保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2 主要試劑 E.Z.N.A.?Stool DNA Kit(OMEGA Biotek Inc,Norcross,USA)、2 ×Taq PCR Master-Mix、DNA 凝膠回收試劑盒、TIANgel Midi Purification Kit 試劑盒,均購自天根生化科技(北京)有限公司。

      1.3 儀器 PCR 儀(TECHNE,TC -1500),小型高速冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5415R,Eppendorf 公司);電泳儀(Thermal cycler Block,Thermo Fisher 公司);凝集成像儀(Gel DocTM XR+,Bio-RAD 公司)。

      1.4 參考株 文章中涉及的肝片形吸蟲、大片形吸蟲、中間型吸蟲的參考株均下載于NCBI 中Gen-Bank。

      1.5 方法

      1.5.1 片形吸蟲處理及DNA 提取 取保存的完整蟲體,PBS 反復(fù)沖洗,研磨、凍融并提取DNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.5.2 引物 根據(jù)GenBank 參考序列,選取片形吸蟲第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(First internal transcribed spacer, ITS-1)和第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(second internal transcribed spacer, ITS-2)基因的特異性引物作為肝片形吸蟲基因分型的PCR 擴(kuò)增引物[2],2 對引物如下:ITS-1(forward:5′ -CCGTAGCCCAAATC -T-3′)和(reverse:5′-TGACTACCCCACGGA -3′);ITS - 2(forward:5′ - ATGCACCCGGTCCT - 3′)和(reverse:5′-CATGACTTACCGAAC -3′),所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

      1.5.3 PCR 反應(yīng)擴(kuò)增體系 ITS-1 引物的PCR 反應(yīng)體系(50 μL):2 ×Taq PCR Master Mix 25 μL,引物ITS - 1F/ITS - 1R 各1 μL,模板DNA 5 μL,ddH2O 18 μL 混勻。 PCR 反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。 取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測;ITS -2 引物的PCR 體系(50 μL):2 ×Taq PCR MasterMix 25 μL,引物ITS- 2F/ITS - 2R 各1 μL,模板DNA 5 μL,ddH2O18 μL 混勻。 PCR 反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。 取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

      1.5.4 PCR 產(chǎn)物純化回收 取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳切膠后,按照TIANgel Midi Purification Kit 試劑盒純化回收PCR 產(chǎn)物。 送北京金諾銳杰基因科技有限公司測序。

      2. 結(jié)果與分析

      2.1 形態(tài)學(xué)特征 解剖鏡下觀察,片形吸蟲背腹呈扁平,外觀呈樹葉狀,蟲體前端有一呈三角形的錐狀突,后端鈍圓,體表有小的皮棘。 口吸盤呈圓形,位于錐狀突前端。

      2.2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果 以片形吸蟲ITS -1 引物、ITS-2 引物,經(jīng)PCR 分別擴(kuò)增出約360 bp、250 bp 大小的目的片段,與預(yù)期的目的片段大小相符(圖1)。

      圖1 肝片形吸蟲PCR 鑒定

      2.3 基因序列分析 以ITS-1 引物擴(kuò)增的ITS-1 基因序列,測序后在NCBI 中BLAST 比對,顯示新疆南疆3 例片形吸蟲ITS-1 基因序列與大片吸蟲參考株ISEM V-966(法屬圭亞那/2004,負(fù)鼠,AJ628403.1)和FgGZB2(中國/2004,牛,AJ628425.1)核苷酸同源性達(dá)98.2%;與肝片形吸蟲參考株FhGSG2(中國甘肅/2004,山羊,AJ628431.1)和FhNJG3(中國江蘇/2004,山羊,AJ628432.1)核苷酸同源性達(dá)100%;與中間型吸 蟲 參 考 株 FgGZB3 (中 國 貴 州/2004, 牛,AJ628426.1)、 FhSCC19 ( 中 國 四 川/2004, 牛,AJ628427.1)、 FhHLJC4 (中 國 黑 龍 江/2004, 牛,AJ628428.1)、 FhNJG4 (中 國 江 蘇/2004, 山 羊,AJ628429.1)、 FhGSG3 (中 國 甘 肅/2004, 山 羊,AJ628430.1)核苷酸同源性達(dá)98.2%(圖2)。

      圖2 片形吸蟲ITS-1 基因核苷酸同源性比較

      圖3 ITS-1 基因序列構(gòu)建的片形吸蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹

      以ITS-2 引物擴(kuò)增的3 例新疆南疆片形吸蟲ITS-2 基因序列與大片吸蟲參考株FgC3(伊朗/2011,牛, JF432073.1)、 Shillong (印 度/2014, 羊,KJ720002.1)核苷酸同源性分別達(dá)98.7%和98.4%;與肝片吸蟲參考株FhF4(中國云南/2011,奶牛,JF496717.1)、FhGZ(廣州/2016,人,KU555843.1)核苷酸同源性達(dá)99.7%;與中間型吸蟲參考株Khanh.Ct.1(越南/2009,牛,AB536917.1)、C -Bf104(埃及/2008,狷羚羊,AB553738.1)、FhHLJC10(中國/2011,JF708041.1)、Itanagar(印度/2014,人,KU720005.1)核苷酸同源性均達(dá)98.7%(圖4)。

      圖4 片形吸蟲ITS-2 基因核苷酸同源性比較

      圖5 ITS-2 基因序列構(gòu)建的片形吸蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹

      3 討論

      新疆是我國5 大牧區(qū)之一,放牧羊寄生蟲病種類繁多,其中消化道寄生蟲對羊的危害嚴(yán)重,導(dǎo)致動物生產(chǎn)性能下降,飼料利用率降低,產(chǎn)品質(zhì)量下降,嚴(yán)重困擾新疆養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。 新疆部分地區(qū)吸蟲感染情況較為嚴(yán)重,井波等2008 年在新疆庫車縣開展的牛羊寄生蟲感染調(diào)查,發(fā)現(xiàn)牛肝片形吸蟲感染率為24.38%,大片形吸蟲感染率為35.74%;羊肝片形吸蟲感染率為76.04%[3]。

      目前普遍認(rèn)為自然界可能存在3 種不同的種類:肝片形吸蟲、大片形吸蟲和介于二者之間的“中間型”。 歐洲、美洲、澳洲地區(qū)只存在肝片形吸蟲,而非洲和亞洲地區(qū)存在肝片形吸蟲和大片形吸蟲[4]。 因此,多年來,非洲和亞洲地區(qū)片形吸蟲的種類鑒定一直存在很多爭議[5]。 有學(xué)者認(rèn)為除了有肝片形吸蟲和大片形吸蟲外,還可能存在片形吸蟲的“中間型”[6-7]。 黃維義(2002 年)等[8]鑒定出我國黑龍江的片形吸蟲有基因雜和型,認(rèn)為是“中間型”的片形吸蟲。

      一些學(xué)者研究表明,ITS -1 序列可作為線蟲、吸蟲、原蟲、昆蟲等寄生蟲分類鑒定的遺傳標(biāo)記。核糖體DNA 的ITS -1 基因、ITS -2 基因作為片形吸蟲種類鑒定的遺傳標(biāo)記,其進(jìn)化速度比較快,用于低級分類階元或近緣種的系統(tǒng)發(fā)育研究具有獨(dú)特的優(yōu)勢[2]。 董世娟(2004)[9]建立的特異PCR 方法,初步認(rèn)為ITS-1 序列可作為遺傳標(biāo)記來區(qū)分大片形吸蟲和肝片形吸蟲,同時也證實(shí)在我國除了此兩種片形吸蟲外,還可能存在著“中間型”的片形吸蟲。

      本試驗通過片形吸蟲ITS -1 基因核苷酸同源性比較分析,發(fā)現(xiàn)新疆南疆3 例片形吸蟲ITS -1 基因型與大片形吸蟲核苷酸同源性為98.2%,與肝片形吸蟲核苷酸同源性為100%,與中間型吸蟲核苷酸同源性為98.2%;ITS-2 基因型與大片形吸蟲核苷酸同源性為98.7%,與肝片形吸蟲核苷酸同源性為99.7%,與中間型吸蟲核苷酸同源性為98.7%。通過ITS-1 基因、ITS -2 基因核苷酸同源性比較、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析說明,本研究中的新疆南疆3 例片形吸蟲為肝片形吸蟲,證實(shí)新疆南疆某羊場存在肝片形吸蟲的感染。 在感染時間、地理分布等方面,新疆南疆某羊場感染的肝片形吸蟲與參考株FhGSG2(中國甘肅/2004,山羊,AJ628431.1)、Fh-NJG3(中國江蘇/2004,山羊,AJ628432.1)、FhF4(中國云南/2011,奶牛,JF496717.1)、FhGZ(中國廣州/2016,人,KU555843.1)相比較,它們都具有相同的遺傳進(jìn)化起源。

      本試驗采用分子生物學(xué)技術(shù),特異性ITS -1 和ITS-2 基因序列引物進(jìn)行鑒定片形吸蟲,傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定與靈敏、特異的的基因分類相結(jié)合,在一定程度上克服了形態(tài)學(xué)鑒定的局限性和主觀性,為新疆的片形吸蟲種類鑒定提供了科學(xué)的參考依據(jù)。

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