周曉，宋悅凡，何云海，汪秋寬，劉舒

(大連海洋大學食品科學與工程學院，國家海藻加工技術研發(fā)分中心，遼寧水產品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧大連116023)

萱藻Scytosiphon lomentaria為一年生廣溫性褐藻[1－3]。藻體為黃褐色至深褐色，管狀，膜質，叢生，單條[4]，每條長度為15～70 cm[5]，在中國的沿海地區(qū)均有分布，其中廣東省海陵島到遼東半島間分布較廣泛，屬溫帶性海藻[6]，萱藻中富含褐藻膠和褐藻糖膠，其中褐藻膠為16.30%，褐藻糖膠為4%[7]。褐藻糖膠又名褐藻多糖硫酸酯 (Fucoidan)，是一種水溶性雜多糖，L－巖藻糖和硫酸根是其主要組成成分[8－9]，另外，還含有甘露糖、半乳糖、蛋白質、木糖、糖醛酸等單糖組成成分，以及鉀、鈉、鈣等金屬離子[10－11]。近年來，因褐藻多糖硫酸酯具有多種生物活性，包括抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂、免疫調節(jié)等[12－16]，對其研究引起了許多科學研究者的關注。

本研究中，以從新鮮萱藻中提取的粗褐藻多糖硫酸酯為原料，分離純化褐藻多糖硫酸酯，分析各組分含量組成及其結構，旨在為萱藻的高效綜合利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

褐藻多糖硫酸酯從新鮮萱藻中提取，由大連海洋大學國家海藻加工技術研發(fā)分中心提供。

1.2 方法

1.2.1 褐藻多糖成分含量的測定

(1)總糖含量。采用苯酚硫酸法，以L－巖藻糖、D半乳糖 (質量比為3∶1)為標準糖，制作標準曲線。

(2)硫酸根含量。采用明膠－BaCl2法，具體測定方法參照文獻[17]。

1.2.2 DEAE－Sepharose Fast Flow弱陰離子交換色譜分離純化 稱取0.4 g褐藻多糖硫酸酯粗品，溶于20 mL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4)中，將溶液通過DEAE－Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱 (1.6 cm×30 cm)，經磷酸鹽緩沖液，0～2.5 mol/L的NaCl溶液以0.75 mL/min的流速梯度洗脫，用自動部分收集器收集。經測定總糖后收集相應洗脫峰，透析，最后冷凍干燥，得到成品。

1.2.3 萱藻褐藻多糖硫酸酯的結構分析

(1)萱藻褐藻多糖硫酸酯的紅外光譜分析。將干燥的樣品2 mg與KBr 98 mg均勻混合，壓制成片，使用Nieolet－Nexus 470傅立葉變換紅外光譜儀，掃描其在4000～400 cm－1波長范圍的光譜吸收值。

(2)萱藻褐藻多糖硫酸酯的核磁共振分析。核磁共振試驗使用Bruker AVANCE III 600 MHz核磁共振儀，在25℃、100.6 MHz條件下進行。

1.2.4 萱藻褐藻多糖硫酸酯的單糖組成分析[18]

使用裝有Agela·Venusil XBP－C18(2)色譜柱和紫外檢測器 (DAD)的Agilent 1260高效液相色譜儀，采用PMP柱前衍生高效液相分析方法。流動相A為15%乙腈＋50 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 6.0)，流動相B為40%乙腈＋50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.0)，梯度0 min 100%A→50 min 50%A。進樣體積為20 μL，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃[18]。單糖標準品取濃度分別為1.0 mmol/L的甘露糖 (Man)、鼠李糖 (Rha)、半乳糖 (Gal)、半乳糖醛酸 (Gal－UA)、葡萄糖醛酸 (Glu－UA)、葡萄糖 (Glu)、木糖 (Xyl)和巖藻糖 (Fuc)的混合單糖。

2 結果與分析

2.1 DEAE－Sepharose Fast Flow弱陰離子交換色譜分離純化

萱藻褐藻多糖硫酸酯經DEAE－Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱層析和NaCl溶液洗脫共得到4個組成成分 (圖1)，即1個流出峰，3個洗脫峰，分別命名為F－0、 F－1、 F－2和F－3， 分別收集各組分，透析、冷凍干燥待用。

圖1 巖藻聚糖硫酸酯梯度洗脫曲線Fig.1 Gradient elution curve of the fucoidan

2.2 萱藻巖藻多糖硫酸酯的單糖組成

各組分組成分析結果如表1所示。其中，F(xiàn)－3的硫酸根和總糖含量最高，分別為21.13%和73.65%，純度為94.78%。

F－0、 F－1、 F－2、 F－3 組分的巖藻糖含量分別為28.13%、1.33%、10.50%、26.12%，各組分的單糖組成含量以巖藻糖含量為單位1進行計算，制得表1。從圖2和表1分析可知，各組分均含有巖藻糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖，但組成比例有所不同。分析發(fā)現(xiàn):F－0和F－3組分中巖藻糖含量較高；F－1組分中甘露糖含量最高，巖藻糖含量較低；F－2組分中鼠李糖含量最高；F－3組分中除巖藻糖含量較高外，半乳糖含量最高；F－0、F－1組分中還含有葡萄糖，但F－2、F－3組分中不含葡萄糖。

2.3 萱藻褐藻多糖硫酸酯的結構分析

2.3.1 紅外光譜分析 從圖3可見，3427～3404 cm－1附近為－OH 伸縮振動， 2943～2931 cm－1附近為糖類CH2伸縮振動， 1039～1037 cm－1附近為 C－O－C/C－OH， 這些是糖類共有的， 858～824 cm－1附近為C－O－S特征吸收峰，表明含有硫酸基，這與明膠－BaC12法測得的結果相符。 分析得知:F－0、F－1、F－2、 F－3組分在850 cm－1附近均有吸收峰， 為C－4的軸向鍵，硫酸根取代的是巖藻糖的C－4位；F－1組分在820 cm－1處有赤道配位的C－O－S伸縮振動吸收峰， 為C－2、 C－3的赤道鍵； F－0在1614.79 cm－1處有羧基的C＝O伸縮振動。

2.3.2 核磁共振分析 從圖4碳譜譜圖可見:在F－0組分中， 推測(100～110)×10－6是 C1的位移，(67～83)× 10－6是 C2 到 C5 的位移， 23× 10－6附近的信號峰為乙?；?(17～19)×10－6對應巖藻糖C6的位移，且含量較高；在F－1組分中，推測(177～179)×10－6出現(xiàn) C＝O信號峰，為糖醛酸的羧基，(140～150)×10－6出現(xiàn)信號峰， 應為C＝C， 但仍需進一步考察，(17～19)×10－6附近出現(xiàn) C6的位移， 推測為鼠李糖C6的特征信號峰；在F－2組分中，(73～83)×10－6是硫酸基或糖基化的位移，因結合紅外光譜，分析S＝O伸縮振動峰是顯示硫酸基的存在，故可以確定(73～83)×10－6為硫酸基位移， 而(17～19)×10－6附近出現(xiàn)信號峰，推測為鼠李糖的特征信號峰；在F－3組分中，根據(jù)單糖組成，可推測出在18×10－6處出現(xiàn)巖藻糖的C6特征信號峰。

表1 各組分總糖、硫酸根含量及單糖組成Tab.1 Total polysaccharide and sulfate contents and monosaccharide composition of all fractions

圖2 單糖組成的液相色譜圖Fig.2 Monosaccharide composition profile of all fractions by liquid chromatography

圖 3 F－0、 F－1、 F－2、 F－3紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of F－0， F－1， F－2 and F－3

3 討論

圖4 F－0、 F－1、 F－2、 F－3的13C 核磁共振譜圖Fig.4 The13C NMR spectra of F－0， F－1， F－2 and F－3

褐藻的產地、品種、提取工藝不同，其褐藻多糖硫酸酯的單糖組成、含量會有明顯差異。張海霞等[18]研究表明，馬尾藻Sargassum褐藻多糖硫酸酯中主要含有甘露糖、半乳糖、巖藻糖。張文靜[19]研究發(fā)現(xiàn)，籠目海帶Kjellmaniella crassifolia和鼠尾藻Sargassum thunbergii褐藻多糖硫酸酯均以巖藻糖為主，還有適量的甘露糖、半乳糖和葡萄糖醛酸等雜多糖。馬偉偉[20]研究證實，海黍子Sargassum miyabei褐藻多糖硫酸酯中巖藻糖是主要成分，也含有甘露糖、半乳糖，以及少量阿拉伯糖和木糖。姜龍等[21]純化樹皮藻Ecklonia maxima巖藻聚糖硫酸酯得到的4個組分中，主要由巖藻糖和半乳糖組成。賈之慎等[22]證明，羊棲菜Sargassum fusiforme粗多糖經層析得到的F－1、F－2組分均是以巖藻糖為主的多糖硫酸酯。

關于萱藻褐藻多糖硫酸酯的結構組成分析研究較少，本試驗中采用酶解法得到萱藻巖藻聚糖硫酸酯產品，用DEAE－Sepharose Fast Flow弱堿性陰離子交換凝膠對萱藻褐藻多糖硫酸酯進行分離純化，得到4個組分， 分別為F－0、 F－1、 F－2和F－3， 其硫酸根含量分別為 10.64%、10.47%、11.93%、21.13%，表明其屬于硫酸多糖，與劉舒[23]分析的結果一致。 本研究中， F－0、 F－1、 F－2、 F－3各組分均含有甘露糖和巖藻糖，其中F－1組分的甘露糖含量遠大于巖藻糖，且鼠李糖、半乳糖的含量也大于巖藻糖，其硫酸根含量相對也較低。

王景峰[24]采用冷水、熱水浸提的方法得到萱藻兩種巖藻聚糖硫酸酯粗品，并在Q－Sepharose FF上用NaCl進行洗脫。發(fā)現(xiàn)冷水浸提及其純化后所得組分的總糖含量和硫酸根含量均高于熱水浸提及其純化后所得組分的含量。分析得知，熱水浸提會使雜質溶解在熱水中，高溫使部分硫酸根脫掉，導致熱水浸提所得的總糖和硫酸根含量較低，糖醛酸和蛋白質含量偏高。

本研究中結合酶解破壁提取，粗體物質經洗脫后得到的組分中，經紅外光譜分析，均含有1254 cm－1處S＝O 伸縮振動峰、 830 cm－1處 C－O－S 伸縮振動峰，顯示硫酸基的存在；經核磁共振分析，F(xiàn)－0、F－3組分中出現(xiàn)巖藻糖C6信號峰，F(xiàn)－1、F－2組分中出現(xiàn)鼠李糖C6信號峰。

參考文獻:

[1] 紀明侯，徐祖洪，郭玉彩.海帶褐藻糖膠的研究[J].水產學報，1980，4(1):9－18.

[2] 馬莉莎，張明.褐藻多糖硫酸酯的研究進展[J].山東醫(yī)藥，2009，49(11):115－116.

[3] 王慶鈞，谷越，楊穎，等.萱藻中巖藻聚糖硫酸脂的提取工藝優(yōu)化及其保肝護肝作用[J].大連海洋大學學報，2015，30(4):417－421.

[4] 羅榮珺，李偉.褐藻多糖硫酸酯的研究進展[J].科技資訊，2011(35):10.

[5] Eluvakkal T，Sivakumar S R，Arunkumar K.Fucoidan in some Indian brown seaweeds found along the coast gulf of Mannar[J].International Journal of Botany，2010，6(2):176－181.

[6] 張宇，付曉婷，林洪，等.萱藻營養(yǎng)品質的分析和評價[J].營養(yǎng)學報，2011，33(6):619－620，623.

[7] 楊會琴，李敬，戴翠萍.海帶中巖藻多糖提取工藝的研究[J].河北師范大學學報:自然科學版，2005，29(4):409－411.

[8] 張連飛，宋淑亮，吉愛國.過硫酸化巖藻多糖硫酸酯[J].生命的化學，2011，31(2):258－261.

[9] Zvyagintseva T N，Shevchenko N M，Popivnich I B，et al.A new procedure for the separation of water－soluble polysaccharides from brown seaweeds[J].Carbohydrate Research，1999，322(1－2):32－39.

[10] 郭遼樸，李洪軍.褐藻膠生物活性及在食品中應用的研究進展[J].四川食品與發(fā)酵，2007，43(6):9－12.

[11] 邱賀媛.九種河北產海藻的營養(yǎng)成分[J].唐山師專學報，1998，20(5):46.

[12] Nishino T，Nagumo T，Kiyohara H，et al.Structural characterization of a new anticoagulant fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome[J].Carbohydrate Research，1991，211(1):77－90.

[13] Springer G F，Wurzel H A，McNeal Jr G M，et al.Isolation of anticoagulant fractions from crude fucoidin[J].Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine，1957，94(2):404－409.

[14] 薛長湖，陳磊，李兆杰，等.巖藻聚糖硫酸酯體外抗氧化特性的研究[J].青島海洋大學學報，2000，30(4):583－588.

[15] 李兆杰，薛長湖，陳磊，等.低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯的清除活性氧自由基和體內抗氧化作用[J].水產學報，2001，25(1):64－68.

[16] 邢永澤.萱藻產業(yè)化研究獲重大進展[N].中國海洋報，2010－05－07.

[17] 張惟杰.復合多糖生化研究技術[M].上海:上海科學技術出版社，1987.

[18] 張海霞，汪秋寬，何云海，等.馬尾藻褐藻多糖硫酸酯的分離純化及結構研究[J].大連海洋大學學報，2016，31(5):559－562.

[19] 張文靜.兩種褐藻中褐藻多糖硫酸酯的結構解析與活性研究[D].青島:中國科學院研究生院(海洋研究所)，2016.

[20] 馬偉偉.海黍子褐藻多糖硫酸酯的分離純化及生物功能研究[D].煙臺:煙臺大學，2013.

[21] 姜龍，宋悅凡，羅宣，等.樹皮藻巖藻聚糖硫酸酯的純化及其化學結構研究[J].大連海洋大學學報，2017，32(1):73－78.

[22] 賈之慎，鄔建敏，鄭海龍，等.洋棲菜中褐藻多糖硫酸酯的分離和組分分析[J].浙江農業(yè)大學學報，1998，24(6):670－673.

[23] 劉舒.三種褐藻中巖藻聚糖硫酸酯的純化及結構分析[D].大連:大連海洋大學，2013.

[24] 王景峰.萱藻巖藻聚糖硫酸酯的制備及其抗血栓活性的研究[D].青島:中國海洋大學，2013.