周向軍,朱敏濤,袁毅君

(天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院,甘肅天水 741001)

糖醇是羰基加氫生成的多元醇化合物,在食品加工過程中常需添加一些天然糖醇類化合物,不僅可改善脫水食品的復(fù)水性、控制結(jié)晶程度和降低水分活度,還可改善蛋白質(zhì)部分功能,如熱穩(wěn)定性、溶解性、起泡性、乳化性、穩(wěn)定性膠凝性等[7-11],糖醇還可穩(wěn)定和保護溶液中的生物大分子、抑制大分子聚集體形成、抑制空氣-水界面的蛋白質(zhì)變性以及提高蛋白乳化液在不同環(huán)境因素條件下的穩(wěn)定性等。功能性糖醇主要包括山梨醇、麥芽糖醇、木糖醇、D-甘露糖醇、赤蘚糖醇和乳糖醇等,其中赤蘚糖醇是一種通過自然發(fā)酵獲得的四碳糖醇,具有一系列優(yōu)點,如極低熱值、極高耐受量和安全性、不易引起腸胃不適、無齲齒性等。根據(jù)不同需要,其添加量可達0.5%～40%,是一種極具應(yīng)用前景的新型天然甜味劑,可作為糖尿病和肥胖癥病人的食糖替代品,在食品行業(yè)廣泛用作抗凍劑、抗氧化劑，從而可延長產(chǎn)品貨架期[12-13]。另外,赤蘚糖醇具有很強的抗氧化性,有助于防止體內(nèi)由高血糖引起的血管損傷。

本文采用8-苯胺基-1-萘磺酸鈉熒光探針法、紫外和熒光光譜法,研究不同質(zhì)量分數(shù)赤蘚糖醇處理豌豆粉時,其對豌豆分離蛋白溶解性、持水性、表面疏水性、紫外及熒光光譜的影響,為豌豆分離蛋白在食品行業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豌豆粉 云南意蜂特產(chǎn)散裝純豌豆粉;8-苯胺基-1-萘磺酸鈉 購自京化成工業(yè)株式會社;赤蘚糖醇 購自Bio Basic Inc公司;牛血清白蛋白(BSA) 購自生工生物工程(上海)股份有限公司;考馬斯亮藍G250、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和正己烷等 均為國產(chǎn)分析純。

RF-5301PC熒光分光光度計 日本島津;UV-1800紫外可見分光光度計 日本島津;722可見分光光度計 上海欣茂有限公司;PHS-3D雷磁pH計 上海精密科學(xué)有限公司;TGL-20M型高速臺式冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司;AL-204型電子天平 梅特勒-托利多有限公司;90-3型定時恒溫雙向磁力攪拌器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 PPI制備 參考Miroljub[14]方法,稍作修改。稱取50.00 g豌豆粉,按1∶5加入正己烷,脫脂兩次。5000 r/min離心15 min,沉淀分散于0.1 mol/L NaCl溶液1250 mL中,調(diào)節(jié)pH9.0,40 ℃水浴攪拌3 h,5000 r/min離心15 min。上清液調(diào)至pH4.5,靜置過夜。8000 r/min離心15 min,沉淀水洗2次,真空干燥得PPI。

1.2.2 溶解性 可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法,其標準曲線制作參考李迎秋[15]方法。標準曲線方程為Y=23.602X-0.0027,R2=0.9988,X為蛋白質(zhì)量,mg；Y為OD595。稱取5.00 g PPI,溶于0.01 mol/L pH7.0磷酸緩沖液95 mL中,攪拌2 h。取2 mL PPI共36份,分成6組,分別加入40%(m/V)赤蘚糖醇0、0.625、1.25、2.5、3.75和5 mL,用蒸餾水補至10 mL,使其終質(zhì)量分數(shù)分別為0、2.5%、5%、10%、15%和20%。處理2 h后,5000 r/min離心15 min,上清液定至25 mL。每組分別用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)pH2.0、3.0、4.0、5.0和6.0。取0.5 mL測定吸光度,計算蛋白質(zhì)含量。溶解性以每克總蛋白所含上清液中蛋白質(zhì)的毫克數(shù)表示,mg/g;總蛋白含量采用凱氏定氮法。

1.2.3 持水性 5.00 g PPI溶于0.01 mol/L pH7.0磷酸緩沖液100 mL中。取5.00 mL PPI溶液共25份,分別加40%赤蘚糖醇液0、0.625、1.25、2.5和5.00 mL,蒸餾水補至10.00 mL。處理2 h后,分別用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)pH3.0、4.0、5.0、7.0和9.0,5000 r/min離心15 min,棄掉上清液,擦掉管壁多余水分,利用稱量法[16]進行水分質(zhì)量測定。

持水性(%)=W0/W1×100

式中:W0為水分質(zhì)量,g;W1為蛋白質(zhì)量,g。

1.2.4 乳化性 稱取1.00 g PPI,溶于100 mL磷酸緩沖液。分別用0、2.5%、5%、10%、20%的赤蘚糖醇處理2 h。準確量取8 mL,加2 mL菜籽油,2500 r/min磁力攪拌3 min后,即刻吸取底部乳濁液50 μL與3 mL SDS溶液中,以SDS溶液為空白,在500 nm 處測定其初始吸光值(A0)及10 min后吸光值(A10),計算乳化活性(EAI)及乳化穩(wěn)定性(ESI)。

式中,N-稀釋倍數(shù)(60);C-蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(g/mL);Φ-乳化液中油相體積分數(shù)(1/4);A0-0 min時吸光值;A10-10 min時吸光值;L-比色皿厚度,1 cm。

1.2.5 起泡性 準確稱取1.00 g PPI,溶于100 mL磷酸緩沖液中。分別用0、2.5%、5%、10%、20%赤蘚糖醇處理2 h,2500 r/min磁力攪拌2 min后,移入量筒中,記錄其初始體積(V1),靜置10 min后體積(V2)和總體積100 mL V總,計算起泡性及泡沫穩(wěn)定性。

1.2.6 紫外光譜 1.00 g PPI溶于0.01 mol/L pH7.0磷酸緩沖液100 mL中,5000 r/min離心15 min,取上清液1 mL,分別加入40%赤蘚糖醇0、0.625、1.25、2.5和5 mL,緩沖液補至10 mL。處理2 h后,進行紫外光譜掃描。

1.2.7 熒光光譜 1.00 g PPI溶于0.01 mol/L pH7.0磷酸緩沖液100 mL中,5000 r/min離心15 min,取上清液5 mL,分別加入40%赤蘚糖醇0、0.625、1.25、2.5和5 mL,補至10 mL,使其終濃度分別為0、2.5%、5%、10%、15%和20%。處理2 h后,在激發(fā)波長280 nm、狹縫寬均為5 nm條件下,進行熒光光譜掃描[17]。

1.2.8 表面疏水性 用0.01 mol/L pH7.0磷酸緩沖液配成2% PPI溶液,5000 r/min離心15 min,取0.02、0.04、0.06、0.08和0.1 mL上清液,添加40%赤蘚糖醇,使其質(zhì)量分數(shù)分別為0、2.5%、5%、10%和20%,蒸餾水補至4 mL。加50 μL ANS溶液,8～15 min內(nèi)測定熒光強度。激發(fā)和發(fā)射波長分別為350、496 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm條件下,以相對熒光強度對PPI質(zhì)量分數(shù)作圖,曲線初始階段斜率為PPI表面疏水性指數(shù)[18]。以表面疏水性指數(shù)為縱坐標,赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)為橫坐標作圖。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 16.0進行ANOVA差異顯著性分析(p<0.05)。采用0rigin7.5作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 PPI基本含量測定

采用凱氏定氮法測得豌豆粉蛋白含量為19.87%±0.09%,PPI蛋白含量為76.87%±0.29%。采用差值法測得水分含量為8.66%±0.06%,采用3,5-二硝基水楊酸法測得總糖含量為2.37%±0.01%。

2.2 赤蘚糖醇對PPI溶解性的影響

不同質(zhì)量分數(shù)赤蘚糖醇對PPI溶解性的影響見圖1。當不同質(zhì)量分數(shù)赤蘚糖醇處理PPI時,其溶解性均在pH4.0處最低,原因是PPI分子中酸性氨基酸比例明顯占優(yōu),Asp含量10 g/100 g蛋白質(zhì),Glu含量20 g/100 g蛋白質(zhì)[4],PPI等電點在pH4.0～5.0范圍[19],此時蛋白質(zhì)發(fā)生聚集而沉淀。在pH2.0、pH3.0和pH6.0時,PPI溶解性相對較高,原因是酸性或中性環(huán)境偏離了等電點pH4.0～5.0范圍[20],增加了PPI解離程度,靜電斥力增加,從而有利于PPI與水分子間形成離子-偶極作用,分散性更好,故溶解性增強。

圖1 赤蘚糖醇對PPI溶解性的影響Fig.1 Effects of erythritol on solubility of PPI

當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)在0～5%范圍時,除pH3.0處理組外,其余各組PPI溶解性均隨其質(zhì)量分數(shù)增大而增加(p<0.05),原因是低質(zhì)量分數(shù)的赤蘚糖醇主要與蛋白質(zhì)分子相互作用形成氫鍵,增強了蛋白質(zhì)表面的水化層,因而減少了蛋白質(zhì)分子間的相互作用,使PPI與水分子間作用力增強[20],故溶解性增大。當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)在0～5%范圍時,pH3.0處理組則先降低后增加,原因有待進一步研究。當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)在5%～15%范圍時,除pH2.0和pH3.0處理組外,其余各組PPI溶解性隨其質(zhì)量分數(shù)增加基本趨于穩(wěn)定(p>0.05),但當繼續(xù)增加赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)時,PPI親水能力逐漸占優(yōu),將不同程度破壞PPI表面水化層,溶解性又逐漸降低。pH3.0處理時,當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)在5%～15%范圍時,均可提高PPI溶解性,這是因為赤蘚糖醇多羥基可間接影響體系中水分子的結(jié)構(gòu),水分子結(jié)構(gòu)的改變,進一步誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子表面更加親水[21],繼續(xù)增大赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)時,PPI溶解性逐漸下降。其余各pH處理組,隨赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)增加,均使PPI溶解性增加。

2.3 赤蘚糖醇對PPI持水性的影響

赤蘚糖醇對PPI持水性的影響見圖2。蛋白質(zhì)持水性本質(zhì)是一種超分子水平作用,是溶脹、粘度增加和凝膠形成等物理化學(xué)綜合作用的體現(xiàn)[22]。隨赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)增加,PPI持水性基本呈逐漸增大趨勢,其中,pH3.0和pH9.0處理組顯著增加(p<0.05),其余各組不顯著(p>0.05)。pH3.0和pH9.0處理時,PPI持水性最高,原因是處于偏酸或偏堿環(huán)境時,PPI帶正電荷或負電荷,同種電荷間相互排斥,更易于與溶劑水分子間產(chǎn)生相互作用。pH5.0時,各處理組持水性均最低。這是因為PPI等電點在pH4.0～5.0范圍內(nèi)[19],此時蛋白質(zhì)分子凈電荷接近零,缺乏蛋白質(zhì)與水分子間的離子-偶極作用,從而持水性最低。

圖2 赤蘚糖醇對PPI持水性的影響Fig.2 Effects of erythritol on water holding power of PPI

2.4 乳化性

不同質(zhì)量分數(shù)赤蘚糖醇對PPI乳化性的影響見圖3。當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)在0～10%范圍時,PPI的乳化性及其穩(wěn)定性均顯著增加(p<0.05),隨后繼續(xù)增大赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)時,PPI乳化性及其穩(wěn)定性均保持平穩(wěn)。這可能是赤蘚糖醇增加了PPI乳液的表觀粘度,使得乳液微粒間碰撞機會減少,因而PPI乳液的穩(wěn)定性增強[17]。

圖3 赤蘚糖醇對PPI持水性的影響Fig.3 Effects of erythritol on emulsifying properties of PPI

2.5 起泡性

不同質(zhì)量分數(shù)赤蘚糖醇對PPI起泡性及其穩(wěn)定性的影響見圖4。當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)在0～5%范圍時,起泡性隨其含量增加而逐漸增加,隨后繼續(xù)增大赤蘚糖醇含量至20%時,起泡性基本保持不變。起泡性的增加,可能是由于赤蘚糖醇使PPI結(jié)構(gòu)更加松散、柔性進一步增加所致。另外,表面疏水性的增加,有利于表面張力下降,因此增加了泡沫的形成能力[18]。當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)在0～20%范圍內(nèi),泡沫穩(wěn)定性始終保持穩(wěn)定。

圖4 赤蘚糖醇對PPI泡沫性的影響Fig.4 Effects of erythritol on spumescence of PPI

2.6 赤蘚糖醇對PPI表面疏水性的影響

不同質(zhì)量分數(shù)赤蘚糖醇對PPI表面疏水性的影響見圖5。當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)在0～2.5%時,表面疏水性逐漸增加,在2.5%～10%范圍時,表面疏水性顯著增大(p<0.05),這表明赤蘚糖醇并不主要與PPI通過氫鍵形成親水層,即未增加蛋白質(zhì)的水化作用,因而表面疏水性增強[23]。另一方面,受赤蘚糖醇的影響,蛋白質(zhì)分子表面的原子或基團結(jié)構(gòu)可能發(fā)生重排,疏水性殘基轉(zhuǎn)至分子外部且排列較為聚集,形成了明顯的疏水區(qū)域,相當于增加了其與ANS的結(jié)合位點[24-26],因而表面疏水性增強。當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)在10%～20%范圍時,表面疏水性趨于穩(wěn)定或略有下降,其原因是PPI空間結(jié)構(gòu)已相當伸展而幾乎徹底解折疊,其表面疏水殘基開始與溶劑體系發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象[27]。

圖5 赤蘚糖醇對PPI表面疏水性的影響Fig.5 Effects of erythritol on surface hydrophobicity of PPI

2.7 赤蘚糖醇對PPI紫外光譜二階導(dǎo)數(shù)的影響

不同質(zhì)量分數(shù)赤蘚糖醇對PPI紫外二階導(dǎo)光譜的影響見圖6。由于PPI分子中Tyr和Trp殘基均在280 nm附近有紫外吸收,普通紫外光譜法難以分辨疊加峰的相互影響,因此,選擇導(dǎo)數(shù)光譜法可消除重疊光譜的干擾,有助于分析芳香族氨基酸微環(huán)境變化。在280～300 nm范圍內(nèi)有兩個最大值(289、296 nm)和兩個最小值(286、291 nm)。296 nm吸收峰是Trp殘基特征性吸收峰。當不同質(zhì)量分數(shù)的赤蘚糖醇處理后,PPI紫外吸收峰發(fā)生1～2 nm藍移,這說明處理后的Trp殘基微環(huán)境更加親水[28]。隨赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)增加,286、289 nm對應(yīng)的谷-峰間縱向距離幾乎未明顯發(fā)生變化,但291、296 nm對應(yīng)的谷-峰間縱向距離明顯降低,當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)在0～10%范圍時,291、296 nm對應(yīng)的二階導(dǎo)數(shù)值之比呈增加趨勢,但當其質(zhì)量分數(shù)繼續(xù)增加時,二階導(dǎo)數(shù)值之比呈減小趨勢,這表明Tyr微環(huán)境由疏水逐漸變得更加親水[28],與后續(xù)熒光光譜結(jié)論相一致。

圖6 赤蘚糖醇對PPI紫外光譜的影響Fig.6 Effects of erythritol on ultraviolet spectrum of PPI

2.8 赤蘚糖醇對PPI熒光光譜的影響

不同質(zhì)量分數(shù)赤蘚糖醇對PPI熒光光譜的影響見圖7。熒光光譜激發(fā)波長為280 nm時,Phe不被激發(fā),PPI最大熒光發(fā)射波長(λmax)為327 nm,可認為是PPI分子中Trp和Tyr殘基的熒光發(fā)射峰[29]。但由于Trp到Tyr殘基間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移,引起了Tyr殘基熒光熄滅和Trp殘基的熒光增強,因此,PPI熒光峰實際是Trp的熒光峰[30]。當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)在0～10%范圍內(nèi),λmax從327nm逐漸增至330 nm,發(fā)生輕微紅移,表明PPI原來包埋在分子內(nèi)部非極性環(huán)境中的Trp或Tyr殘基逐漸暴露于分子表面[31],其微環(huán)境極性增強,這可能是糖醇與PPI發(fā)生相互作用而促進其解聚造成的。但當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)增至20%時,λmax逐漸藍移至327 nm,與未處理組λmax一致,原因是解聚的PPI分子通過疏水相互作用和氫鍵等分子間作用力,重新形成聚集體,同時,高質(zhì)量分數(shù)赤蘚糖醇的親水能力較強,使Trp殘基周圍水分子減少,部分Trp殘基又逐漸被包埋進分子內(nèi)疏水微環(huán)境中[32-33]。當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)在0～2.5%范圍內(nèi),熒光強度逐漸增加,進一步增大赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù),熒光強度呈穩(wěn)定趨勢,這可能是已解聚的Tyr殘基不斷補充的結(jié)果。當繼續(xù)增加赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)至20%時,由于暴露的部分Trp殘基與發(fā)生熒光猝滅的Trp部分達到平衡[35],而使熒光強度不再增大。

圖7 赤蘚糖醇對PPI熒光光譜的影響Fig.7 Effects of erythritol on fluorescence spectroscopy of PPI

3 結(jié)論與討論

隨赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)增加,除pH3.0組外,其余各組PPI溶解性呈先增加后下降趨勢,且均在pH4.0處最低,與表面疏水性變化并不完全一致。持水性逐漸增加,各處理組均在pH5.0處最低。表面疏水性呈先增加后趨于穩(wěn)定趨勢,疏水基團進一步暴露,熒光強度先逐漸增加后趨于穩(wěn)定,且與表面疏水性呈正相關(guān)。

不同糖醇由于其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)存在差異,對不同蛋白質(zhì)溶解性的影響不同。由于溶解性較好的蛋白質(zhì),一般其表面存在相對較少的疏水性氨基酸殘基,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性降低。本實驗中當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)小于15%時,除pH3.0處理組外,其余各組溶解性和表面疏水性保持一致,呈逐漸增加趨勢,但當赤蘚糖醇質(zhì)量分數(shù)大于15%時,其溶解性和表面疏水性變化并不一致,這說明較高濃度糖醇質(zhì)量分數(shù)對食品蛋白質(zhì)溶解性具有較大影響。一般而言,糖醇可增加蛋白質(zhì)持水力,本實驗也證明了這一點。潘明喆[17]研究表明,甘露醇、山梨醇和木糖醇對大豆分離蛋白溶解性的影響有明顯不同,三種糖醇均使大豆分離蛋白表面疏水性和熒光強度降低,作者認為,糖醇使蛋白質(zhì)分子的Trp等疏水殘基發(fā)生內(nèi)裹作用,因而降低了表面疏水性和熒光強度,與本實驗結(jié)論不一致。但王忠江[35]研究表明,Trp和Tyr殘基的微環(huán)境變化,仍無法預(yù)測非變性狀態(tài)下蛋白質(zhì)表面疏水性變化,可能原因是非變性條件下,蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)并未發(fā)生類似于變性過程中的解折疊現(xiàn)象,疏水基團未徹底釋放,而是逐漸卷曲為其它構(gòu)象,使疏水殘基得以“暴露”,這種“暴露”對表面疏水性的影響不具代表意義。

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