馬麗娜，馬 青，李穎康

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002）

微衛(wèi)星（microsatellite）一般由大小為2～6 bp的DNA分子組成核心序列，通常重復(fù)10～20次，首尾相接組成短串聯(lián)重復(fù) （short tandem repeat，STR），又稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeat，SSR）。微衛(wèi)星普遍存在于真核生物的基因組中，平均每10 kb就出現(xiàn)一個(gè)STR。微衛(wèi)星因具有數(shù)量多、分布廣、多態(tài)性豐富、呈共顯性遺傳方式以及檢測(cè)快速方便等優(yōu)點(diǎn)而備受推崇。筆者以灘羊?yàn)檠芯繉?duì)象，在參考國(guó)內(nèi)地方品種綿羊微衛(wèi)星研究的基礎(chǔ)上，選取12個(gè)對(duì)灘羊體重有影響的數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTLs），通過分析這些標(biāo)記在灘羊群體中的遺傳變異特征，以期為灘羊種質(zhì)特性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)灘羊51只，來自鹽池灘羊繁育中心核心育種群。用采樣剪剪取羊耳組織塊少許作為試驗(yàn)材料，放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提?。豪么胖榉▌?dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行樣本DNA提取。

1.2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記與引物合成：根據(jù)已發(fā)表的綿羊基因組遺傳連鎖圖譜以及綿羊和牛相關(guān)QTLs定位的研究成果，從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取綿羊染色體上的12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，其中，從第1號(hào)染色體上選取8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，分別為：BM6506、BM7145、BMS2263、ILSTS004、MCM58、BMS1636、CSSM004、MCM130；從綿羊第2號(hào)染色體上選取4個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，分別為：BL1080、BMS678、ILSTS30、BMS1591。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物用4種熒光染料FAM、ROX、TAMRA和HEX進(jìn)行標(biāo)記，全部標(biāo)記經(jīng)多重PCR反應(yīng)優(yōu)化組合。選取的12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)的引物信息見表1。

1.2.3 建立最佳PCR反應(yīng)體系與條件：采用25 μL多重 PCR 反應(yīng)體系，其中，樣本 DNA（50 ng）1 μL，上游引物 F（100 mmol/L）0.5 μL，下游引物 R（100 mmol/L）0.5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 17.8 μL。 PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 3 min；95℃變性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 30 s，循環(huán)數(shù) 10個(gè)；95℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，循環(huán)數(shù) 20個(gè)；72℃修復(fù)延伸6 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：多重PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電泳條件為：電壓150 V，電流100 mA，時(shí)間20 min。

表1 12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)引物

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Genemapper軟件分析STR數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)電泳檢測(cè)結(jié)果

12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)多重PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1和圖2。由圖1和圖2可知，各微衛(wèi)星標(biāo)記均表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性。隨機(jī)抽樣進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果表明，微衛(wèi)星擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。

2.2 12個(gè)微衛(wèi)星多重PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

將多重PCR產(chǎn)物送往生工生物工程 （上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。根據(jù)12個(gè)微衛(wèi)星多重PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果，得到有多態(tài)性的12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在灘羊群體中的等位基因頻率和等位基因型頻率。由表2可知，在灘羊群體的12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中共檢測(cè)到109個(gè)等位基因，平均每個(gè)標(biāo)記的等位基因數(shù)為9.08個(gè)，其中標(biāo)記BMS678等位基因數(shù)最多，為14個(gè)；標(biāo)記BMS1636的等位基因數(shù)最少，只有5個(gè)。微衛(wèi)星位點(diǎn)選擇標(biāo)準(zhǔn)為：每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)至少應(yīng)有4個(gè)等位基因才能很好地用于遺傳多樣性評(píng)估。而該試驗(yàn)所選取的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因均在4個(gè)以上，因此，有多態(tài)性的這些位點(diǎn)都可以用于灘羊群體的遺傳多樣性評(píng)估。

圖1 9個(gè)微衛(wèi)星多重PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

表2 灘羊12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因及基因型特性

表2（續(xù)） 灘羊12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因及基因型特性

圖2 3個(gè)微衛(wèi)星多重PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

2.3 12個(gè)微衛(wèi)星基因座群體遺傳學(xué)分析結(jié)果

由表3可知，所選微衛(wèi)星標(biāo)記等位基因數(shù)較多，平均達(dá)8個(gè)，多態(tài)信息含量（PIC）平均值為0.777 1，微衛(wèi)星純合度（G）平均值為 0.148 0，微衛(wèi)星標(biāo)記雜合度（H）平均值為0.724 4，表明微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)信息含量豐富，為QTLs的定位提供了強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)支撐。

3 討論

基因純合度是每個(gè)個(gè)體的純合基因座占總檢測(cè)基因座的比例。該研究選取的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，BMS1636的純合度最小，BL1080的純合度最大。該研究檢測(cè)的灘羊群體平均基因純合度為0.148 0。多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）是衡量基因片段多態(tài)性或基因變異程度的一個(gè)指標(biāo)，當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，該基因座為高度多態(tài)基因座，當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時(shí)為中度多態(tài)基因座，當(dāng)PIC＜0.25時(shí)為低度多態(tài)基因座。根據(jù)該判定標(biāo)準(zhǔn)，筆者所選擇的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均為高度多態(tài)基因座。雜合度又稱為基因多樣度，其反映群體在多個(gè)基因座上的遺傳變異特征，一般認(rèn)為它是度量群體遺傳變異的最適參數(shù)。在該研究中，BM7145、BMS2263、ILSTS30 和 BMS1591 微衛(wèi)星基因座的等位基因頻率分布不均勻，每個(gè)基因座都有一種或幾種等位基因頻率較高。微衛(wèi)星的多態(tài)性能夠反映物種的進(jìn)化歷史，群體中頻率最高的等位基因是該物種中最原始、最保守的，其余的等位基因是進(jìn)化過程中由該等位基因突變形成的。BM7145基因座的119bp等位基因、BMS2263基因座的152 bp等位基因、ILSTS30基因座的153 bp等位基因、BMS1591基因座的230 bp等位基因可能是綿羊相應(yīng)微衛(wèi)星基因座最原始的等位基因。

表2（續(xù)） 灘羊12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因及基因型特性

古麗尼沙·吐拉甫［1］以新疆山羊和青格里絨山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，選取17個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)4個(gè)特殊的微衛(wèi)星位點(diǎn)，新疆山羊微衛(wèi)星標(biāo)記BM1824的AD基因型個(gè)體、青格里絨山羊微衛(wèi)星標(biāo)記BM1824的BE基因型個(gè)體、BM6506的CC基因型個(gè)體和LSCV15的BD基因型個(gè)體，不僅絨細(xì)度較細(xì)，而且產(chǎn)絨量指標(biāo)也比較理想。蘇杰［2］采用微衛(wèi)星標(biāo)記和PCR-RFLP 2種方法尋找與波爾山羊生長(zhǎng)以及繁殖性狀相關(guān)的標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)（LSCV11、MCM218、MAF050）在山羊群體中多態(tài)性較豐富，可以用于山羊遺傳多樣性的評(píng)估。任正平［3］研究發(fā)現(xiàn)，2號(hào)染色體的6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在湖羊群體中均屬于高度多態(tài)性標(biāo)記，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，可作為有效的遺傳標(biāo)記用于綿羊遺傳多樣性的分析。賈蘭萍［4］利用第1號(hào)染色體上11個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，采用父系半同胞設(shè)計(jì)對(duì)涼山細(xì)毛羊體重QTLs進(jìn)行了研究。張翔宇等［5］在綿羊第1、2、3、9號(hào)染色體上選取了22個(gè)微衛(wèi)星基因座，其中5個(gè)微衛(wèi)星基因座對(duì)體重影響顯著。顧亞玲等［6］將寧夏地區(qū)普遍飼養(yǎng)的5個(gè)品種169只羊的4個(gè)微衛(wèi)星基因座作為候選標(biāo)記，對(duì)其多態(tài)性進(jìn)行遺傳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)品種在4個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)出多態(tài)性。儲(chǔ)明星等［7］利用5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記（OarAE101、BM1329、BMS2508、TGLA54 和 TGLA68）對(duì) 244 只小尾寒羊母羊進(jìn)行遺傳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)OarAE101基因座的97 bp等位基因、BMS2508基因座的99 bp等位基因、BM1329基因座的164 bp等位基因、TGLA54基因座的134 bp等位基因可能是綿羊相應(yīng)微衛(wèi)星基因座最原始的等位基因。

表3 12個(gè)微衛(wèi)星遺傳信息分析結(jié)果

4 結(jié)論

位于綿羊第1號(hào)染色體的BM7145基因座的119 bp等位基因和BMS2263基因座的152 bp等位基因以及位于綿羊第2號(hào)染色體的ILSTS30基因座的153 bp等位基因、BMS1591基因座的230 bp等位基因，可能是綿羊相應(yīng)微衛(wèi)星基因座最原始的等位基因，這些基因型可作為灘羊遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記。

參考文獻(xiàn)：

［1］古麗尼沙·吐拉甫.新疆地方山羊品種微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳多態(tài)性與部分經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［2］蘇杰.7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記與波爾山羊生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［3］任正平.湖羊2號(hào)染色體6個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)性及其與早期生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［4］賈蘭萍.利用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行涼山半細(xì)毛羊體重QTL研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

［5］張翔宇，張秀華，吳登俊，等.涼山半細(xì)毛羊微衛(wèi)星標(biāo)記與體重性狀的相關(guān)關(guān)系的研究［J］.中國(guó)畜牧雜志，2009，45（11）：1-5.

［6］顧亞玲，王新燕，吳宗山.微衛(wèi)星DNA技術(shù)在肉羊雜種優(yōu)勢(shì)利用中的研究［J］.畜牧與獸醫(yī)，2009，41（5）：59-61.

［7］儲(chǔ)明星，王吉振，王愛國(guó)，等.小尾寒羊五個(gè)微衛(wèi)星基因座遺傳多態(tài)性研究［J］.遺傳學(xué)報(bào)，2002，29（6）：502-506.