胡耀華，陽(yáng)慧，吳翔，符春苗，邵運(yùn)祿，鄭才玲，卓書偉

（海南省中醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科，2.婦產(chǎn)科，海南 ?？?570203）

甲型病毒性肝炎（hepatitis a virus，HAV）對(duì)人類健康危害極大，2001年MCINTIRE等[1]發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的基因T細(xì)胞免疫球蛋白域蛋白（T cell immunoglobulin domain and mucin domain，TIM）家族，包括TIM-1、TIM-3及TIM-4。TIM-1是HAV受體-1（hepatitis A virus cellular receptor 1，HAVCR-1），TIM-4是TIM-1的天然配體[2-4]。在HAV發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的不同階段，目前國(guó)內(nèi)外均未報(bào)道TIM-1、TIM-4的表達(dá)和作用。本研究擬通過(guò)檢測(cè)HAV患者外周血TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)水平，探討其與HAV的關(guān)系，為防治HAV提供新的思路和靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月-2016年10月海南省中醫(yī)院收治的30例HAV患者作為HAV組。其中，男性21例，女性9例；年齡35～62歲，平均（46±1.3）歲。同期選取30例健康體檢者作為對(duì)照組。所有患者依據(jù)臨床癥狀、體征、肝功能檢查結(jié)果及抗-HAV免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）陽(yáng)性確診為HAV，并根據(jù)臨床癥狀和體征分為潛伏期、黃疸期及恢復(fù)期。參照2000年9月西安中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)和肝病學(xué)分會(huì)修訂的病毒性肝炎防治方案的標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.2 靜脈血標(biāo)本

根據(jù)HAV疾病進(jìn)展的3個(gè)階段，分別收集30例HAV-IgM陽(yáng)性患者的靜脈血標(biāo)本。潛伏期或黃疸前期（患者畏寒發(fā)熱、全身乏力、食欲不振、厭油、惡心、嘔吐及上腹部飽脹感或輕度腹瀉等）：采集乙二胺四乙酸二鉀（Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-K2）全血2 ml及不抗凝血3 ml分離血清；黃疸期（觀察患者鞏膜、皮膚黃染程度，第2～7天）：采集EDTA-K2全血2 ml及不抗凝血3 ml分離血清；恢復(fù)期（患者癥狀消失、肝脾正常，第22～42天）：采集EDTA-K2全血2 ml及不抗凝血3 ml分離血清。對(duì)照組分別在第1、7及30天采集靜脈血，EDTA-K2全血2 ml及不抗凝血3 ml分離血清。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成應(yīng)用生物信息學(xué)知識(shí)，根據(jù)GeneBank中的TIM-1和TIM-4 mRNA以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA全長(zhǎng)序列，用Primer Express軟件設(shè)計(jì)目的基因TIM-1、TIM-4和內(nèi)參照基因GAPDH引物。TIM-1正向引物：5’-CTAGCTAGCGCCACCATG-3’，反向引物：5’-GGGGTACCTTAGTCCGTG-3’；TIM-4正向引物：5’-CCGCTACAGGCCTACCATGTCCA-3’，反向引物：5’-GGGGTACCGTTGGCATTG-3’；GAPDH正向引物：5’-TGAGGTCAATGAAGGGGTCG-3’，反向引物：5’-TCTTGTGCAGTGCCAGCCT-3’。以上引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞的獲取及總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄將Ficoll分離液和預(yù)先稀釋的抗凝全血加入離心管中，2 000 r/min離心20min，小心吸取密集在血漿層和分層液界面中呈白色霧狀的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/L。用Trizol一步法抽提外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，分析光密度（optical density,OD）260/OD280純度，選取比值在1.8～2.0的樣品進(jìn)行檢測(cè)，使用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.3.3 反應(yīng)條件采用美國(guó)Applied Biosystems公司的SYBR? Green PCR Core Reagents試劑盒。在專用檢測(cè)板上配制各管反應(yīng)液，總體系25μl。于聚合酶鏈?zhǔn)剑╬olymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)儀中進(jìn)行反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)體10×PCR緩沖液 2μl，25mmol/L Mg2+3.5μl，10mmol/L 高質(zhì)量的脫氧核糖核苷酸0.4μl，10μmol/L引物各0.5μl，普通TaqDNA聚合酶1u（1 u/μl），SYBR Green I 20×1μl，滅菌H2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，94℃變性10 s，59℃退火15 s，72℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)后分別進(jìn)行熒光檢測(cè)，并做熔解曲線對(duì)PCR產(chǎn)物的特異性進(jìn)行鑒定，最后反應(yīng)冷卻至40℃。

1.3.4 HAV患者外周血HAV RNA含量qRTPCR反應(yīng)條件同1.3.3，正向引物：5’-TCTTTGTTCCA GGGCTCTCC-3’；反向引物：5’-GCTCTTCCTCA ATGTCTGCC-3’。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法

采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血中IgM和免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體，Cut-off值＜0.8為陰性，0.8～1.1為弱陽(yáng)性（可疑），≥1.1為陽(yáng)性。具體步驟：向相應(yīng)微孔中加100μl標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及待檢標(biāo)本。室溫（18～25℃）溫育30min，倒掉板內(nèi)液體，用清洗緩沖液洗板3次，拍干，滴加酶結(jié)合物100μl/孔室溫（18～25℃）溫育30min，洗板3次，拍干，滴加顯色液A和B各100μl，室溫（18～25℃）避光溫育15min后加終止液100μl，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)Cut-off值。

1.5 肝功能檢測(cè)

采用7600型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）檢測(cè)肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，AST）及總膽紅素（total bilirubin，TBIL）。使用血清標(biāo)本，方法參照儀器和試劑盒說(shuō)明書。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)（方差不齊），獨(dú)立樣本兩兩比較用Nemenyi檢驗(yàn)，相關(guān)分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)水平比較

由qRT-PCR反應(yīng)曲線得到Ct值，計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，采用GAPDH作為內(nèi)參照。ΔCt=Ct目的基因－CtGAPDH。其中HAV患者TIM-1和TIM-4 mRNA的Ct值分別為38.029～3.272logX（r=0.927）、32.719～2.582logX（r=0.975）。兩組患者在HAV感染的不同時(shí)期TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=4.768，P=0.013），HAV組高于對(duì)照組，其表達(dá)水平較潛伏期升高數(shù)倍，黃疸期達(dá)峰值，恢復(fù)期降低，但仍高于對(duì)照組。兩組患者恢復(fù)期TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=3.963，P=0.027）。不同時(shí)期的TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=11.975和15.482，均P=0.000）；潛伏期與恢復(fù)期TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 兩組患者TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 HAV患者不同時(shí)期TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)水平與HAV RNA含量的相關(guān)性

由qRT-PCR反應(yīng)曲線得到Ct值，計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，采用GAPDH作為內(nèi)參照。ΔCt=Ct目的基因－CtGAPDH。 得 Ct=40.049～ 3.579logX（r=0.955）。TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與HAV mRNA表達(dá)水平一致，于黃疸期達(dá)峰值（r=0.752，P=0.035）。其中HAV在潛伏期、黃疸期及恢復(fù)期的陽(yáng)性率分別為13.3%（4/30）、100%（30/30） 和 46.7%（14/30）。 其mRNA表達(dá)水平于黃疸期增高，最高達(dá)7.2×104Copies。

2.3 HAV患者外周血TIM-1、TIM-4 mRNA表達(dá)水平與HAV抗體、IgM及IgG滴度的相關(guān)性

由ELISA法測(cè)得外周血中HAV抗體IgM和IgG水平。不同時(shí)期IgM、IgG及HAV RNA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中IgM潛伏期就有較高水平，隨著病情不斷進(jìn)展于黃疸期達(dá)峰值，恢復(fù)期下降，黃疸期、潛伏期和恢復(fù)期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=11.221和9.478，均P=0.000）。而IgG在潛伏期水平較低，黃疸期和恢復(fù)期持續(xù)升高，潛伏期與黃疸期、恢復(fù)期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=5.324和7.332，P=0.011和0.002）。HAV RNA黃疸期與潛伏期、恢復(fù)期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=6.145和4.234，P=0.003和0.023），潛伏期與恢復(fù)期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HAV患者病情進(jìn)展不同時(shí)期血清中TIM-1、TIM-4 mRNA表達(dá)水平與IgM滴度變化呈正相關(guān)（r=0.790和0.900，均P=0.000）。HAV患者不同時(shí)期血清中TIM-1、TIM-4 mRNA表達(dá)水平與IgG滴度變化無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見表1、2。

2.4 HAV患者不同時(shí)期TIM-1、TIM-4 mRNA表達(dá)水平與ALT、AST及TBIL含量的相關(guān)性

ALT、AST及TBIL 3個(gè)指標(biāo)均從潛伏期開始增加，至黃疸期達(dá)峰值，進(jìn)入恢復(fù)期后逐漸下降并恢復(fù)正常。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HAV患者不同時(shí)期血清中TIM-1、TIM-4 mRNA表達(dá)水平與AST、TBIL含量呈正相關(guān)（P＜0.05），ALT含量與TIM-1 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。其中TIM-1、TIM-4 mRNA 表達(dá)水平與TBIL含量的最相關(guān)。見表2。

表1 HAV患者病情進(jìn)展不同時(shí)期IgM、IgG及HAV RNA水平比較 （±s）

表1 HAV患者病情進(jìn)展不同時(shí)期IgM、IgG及HAV RNA水平比較 （±s）

時(shí)期 IgM/（IU/L） IgG/（IU/L） HAV RNA潛伏期 1 115.000±594.392 273.334±181.589 1 506.667±531.906黃疸期 3 193.334±1 478.800 1 361.667±611.342 4 4445.591±1 4445.912恢復(fù)期 270.000±165.237 1 461.667±547.358 940.025±1 265.892 H值 11.771 9.972 14.087 P值 0.000 0.000 0.000

表2 HAV患者不同時(shí)期TIM-1、TIM-4 mRNA表達(dá)水平與IgM、IgG滴度，ALT、AST及TBIL含量的相關(guān)性

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HAV患者血清中有較高的TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)水平，且高于健康人群。其表達(dá)水平與HAV患者HAV RNA、IgM滴度及肝功能損傷水平成正相關(guān)。

TIM-1集成表達(dá)于T細(xì)胞表面，作為一種輔刺激分子，對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)有重要作用，可以促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)NKT細(xì)胞殺傷能力，以及調(diào)節(jié)增強(qiáng)腫瘤抗原相關(guān)的1型免疫反應(yīng)。鼠系研究表明，TIM-4是TIM-1的天然配體，集成性表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞，特別是成熟的樹突狀細(xì)胞[5-6]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TIM-4可誘導(dǎo)TIM-1胞內(nèi)尾巴區(qū)酪氨酸磷酸化，從而提供1個(gè)共刺激信號(hào)，增強(qiáng)白細(xì)胞介素-4啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，并激活T細(xì)胞核因子轉(zhuǎn)錄和活化蛋白-1促使T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生[7-8]。在T細(xì)胞增殖調(diào)控方面，TIM-1和TIM-4協(xié)同作用有重要意義[9]。同時(shí)TIM-1作為HAV的細(xì)胞表面受體，可能參與HAV的發(fā)生[6]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，在HAV患者潛伏期，HAV RNA、IgM水平還處于較低水平時(shí)，TIM-1和TIM-4 mRNA表達(dá)水平相比于健康人群升高，其靈敏性高于前者。推測(cè)HAV在感染肝細(xì)胞前可能先與TIM-1病理性結(jié)合從而激活NKT細(xì)胞，給NKT細(xì)胞提供增殖信號(hào)，使NKT細(xì)胞大量復(fù)制，參與肝細(xì)胞的免疫損傷。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，HAV與TIM-1結(jié)合可以介導(dǎo)病毒插入靶細(xì)胞膜并進(jìn)入宿主細(xì)胞，具體過(guò)程為HAV與TIM-1的D1結(jié)構(gòu)域結(jié)合，吸附到易感細(xì)胞表面，在黏膜樣區(qū)域的協(xié)同作用下，HAV外殼蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，將病毒表面與細(xì)胞融合相關(guān)的區(qū)域暴露出來(lái)，HAV與TIM-1融合，隨著融合孔增大，HAV繼而插入靶細(xì)胞膜并進(jìn)入宿主細(xì)胞[4,10-11]。

1例HAV患者發(fā)生肝衰竭，其血清中TIM-1和TIM-4 mRNA呈高表達(dá)，且迅速發(fā)生黃疸。其肝功能急劇惡化，HAV RNA水平卻在檢測(cè)下限，同時(shí)HAV IgM也呈低表達(dá)，這可能是由于HAV不是本身攻擊肝細(xì)胞，而是其抗原所導(dǎo)致的一種免疫損傷。這與國(guó)外人群研究，嚴(yán)重肝衰竭HAV患者血清中有著低濃度的病毒載量結(jié)論一致[11]。也有阿根廷HAV患兒的研究表明，HAV感染從無(wú)癥狀疾病到暴發(fā)性肝衰竭與HAV RNA的病毒載量無(wú)關(guān)，而與TIM-1多態(tài)性（TIM-1長(zhǎng)形式）相關(guān)，嚴(yán)重HAV誘導(dǎo)的肝衰竭可能與長(zhǎng)形式TIM-1結(jié)合甲肝病毒有效率有關(guān)[8,12]。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，相比于HAV RNA病毒載量和HAV IgM水平，TIM-1和TIM-4 mRNA水平對(duì)于HAV的發(fā)病及預(yù)后的預(yù)測(cè)更加靈敏，但是實(shí)驗(yàn)對(duì)于預(yù)測(cè)的特異性沒(méi)有深入研究，接下來(lái)將對(duì)TIM-1和TIM-4 mRNA在HAV的具體發(fā)病機(jī)制作進(jìn)一步研究。相信對(duì)TIM家簇基因與疾病的相關(guān)研究，必將加深人們對(duì)HAV免疫發(fā)病機(jī)制的理解，為HAV的預(yù)防、診斷和治療提供新思路。

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