奶牛隱性乳房炎金黃色葡萄球菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

謝 昆， 蔣成硯， 鄭秋燕， 周文樹， 唐秀華， 汪 鏡

(紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自 661100)

奶牛乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，它一直是困擾奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)效益及迅速發(fā)展的重要原因之一，隱性乳房炎是乳房炎的一種，流行面廣，為臨床型乳房炎的15～40倍，引起奶產(chǎn)量降低4%～10%，影響牛奶質(zhì)量，并易轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床型乳房炎，造成更為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。引起隱性乳房炎的因素有多種，如物理、化學(xué)、機(jī)械、微生物感染等，其中葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原物之一，據(jù)報(bào)道約有1/2以上的乳房炎都是由該細(xì)菌引起的，對(duì)奶牛乳腺組織造成損傷，使產(chǎn)奶量降低，奶牛的使用年限大大縮短，牛奶的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受到影響，還制約著乳品加工業(yè)的健康發(fā)展，給乳制品工業(yè)帶來(lái)巨大損失[2]。

近年來(lái)，隨著我國(guó)牛奶業(yè)的發(fā)展，在葡萄球菌方面關(guān)注度越來(lái)越高，對(duì)于葡萄球菌的研究也越來(lái)越深入，基本鑒定方法有4種，包括血漿凝固酶法、DNA分解酶法、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)、溶血現(xiàn)象。其中金黃色葡萄球菌不僅影響奶牛的泌乳量而且嚴(yán)重影響乳汁的衛(wèi)生質(zhì)量，它與鏈球菌、大腸桿菌所引起的乳房炎約占奶牛乳房炎的90%以上[3-4]。

本研究從新鮮牛奶中分離引起隱性乳房炎的金黃色葡萄球菌，通過(guò)細(xì)菌的培養(yǎng)、染色鑒定、生理生化試驗(yàn)，對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，鑒定后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以期獲得敏感性的抗生素，為隱性乳房炎的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為新鮮牛奶，采自蒙自養(yǎng)殖戶，無(wú)菌采集后帶回試驗(yàn)室在4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨普通培養(yǎng)基，血皿普通培養(yǎng)基，麥康卡培養(yǎng)基，甲基紅培養(yǎng)基，亞硝酸還原培養(yǎng)基，糖類發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(發(fā)酵管)。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)及純化

將樣品按10倍梯度稀釋后，接種在普通瓊脂培養(yǎng)基和血皿培養(yǎng)基上，在37 ℃條件下無(wú)氧培養(yǎng)24 h，待菌落長(zhǎng)出后，經(jīng)過(guò)2種培養(yǎng)基上菌落的對(duì)比，在血皿培養(yǎng)基上挑出有溶血圈的可疑菌落，將可疑菌落繼續(xù)接種在以上2種培養(yǎng)基上，并同時(shí)接種在麥康卡培養(yǎng)基上，而在前2種培養(yǎng)基中細(xì)菌均能正常生長(zhǎng)，在最后一種培養(yǎng)基上則不生長(zhǎng)，將這種菌株反復(fù)在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)，劃線分離，直至菌落較純化。待菌株生長(zhǎng)良好后，仔細(xì)觀察菌落形態(tài)。

1.4 細(xì)菌形態(tài)鑒定

分離的細(xì)菌首先進(jìn)行革蘭氏染色，后再在顯微鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.5 生理生化鑒定

將分離得到的革蘭氏染色為陽(yáng)性的細(xì)菌做過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，凡是革蘭氏染色為陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶產(chǎn)生氣泡的細(xì)菌均暫定為葡萄球菌屬，再進(jìn)一步做甲基紅試驗(yàn)、各種發(fā)酵糖試驗(yàn)、硝酸還原試驗(yàn)、血凝固酶試驗(yàn)。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》來(lái)確定所屬的種。

1.6 PCR鑒定

采用CTAB法提取經(jīng)過(guò)生理生化鑒定的細(xì)菌DNA，根據(jù)GenBank上發(fā)表的金黃色葡萄球菌16S rRNA序列(NR_075000)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物如下，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 1 521 bp。

P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，

P2：5′-TCCGATACGGCTACCTTGTTACG-3′。

以細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：94 ℃的預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)。將檢測(cè)正確的PCR產(chǎn)物送交生工生物(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank上發(fā)表的金黃色葡萄球菌16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較。

1.7 藥敏試驗(yàn)

將經(jīng)生理生化鑒定后的細(xì)菌涂布在培養(yǎng)皿上，并把各種藥敏片標(biāo)記后放在該培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)24 h之后觀察結(jié)果。觀察抑菌圈的大小，用抑菌圈大小判定各種藥敏片對(duì)細(xì)菌的敏感程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

在血皿培養(yǎng)基上，菌落周圍有溶血現(xiàn)象，出現(xiàn)溶血圈，菌落為圓形，平板形成濕潤(rùn)、表面光滑、邊緣有些不整齊，呈白色或金黃色，中央有凸起的菌落(圖1)。葡萄球菌的菌體都是圓形的，一般在顯微鏡下觀察是呈葡萄串狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性(圖2)。

所分離的葡萄球菌的形態(tài)特征，菌落直徑在0.5～1.5 mm 之間，凸起、圓形、光滑、金黃色，偶爾也為白色；細(xì)菌為圓形，通常是以葡萄串狀存在，偶爾有單個(gè)，缺乏鞭毛。

2.2 病原菌的生理生化鑒定

本試驗(yàn)對(duì)牛奶中分離得到的葡萄球菌進(jìn)行生理生化鑒定，由表1可知，革蘭氏染色試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、血凝固酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硝酸還原試驗(yàn)等均為陽(yáng)性，根據(jù)形態(tài)特征和常規(guī)的生理生化鑒定結(jié)果，試驗(yàn)分離出的細(xì)菌確定為葡萄球菌屬。

表1 分離細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

注：+為陽(yáng)性反應(yīng)，-為陰性反應(yīng)。

2.3 病原菌發(fā)酵特性分析

將分離到的葡萄球菌屬的菌株，做進(jìn)一步的發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行種的鑒定。

由表2可知，所分離出來(lái)的葡萄球菌是金黃色葡萄球菌。

表2 分離株的糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

注：+為陽(yáng)性反應(yīng)，-為陰性反應(yīng)。

2.4 病原菌的PCR鑒定

經(jīng)生理生化鑒定的病原菌，設(shè)計(jì)1對(duì)金黃色葡萄球菌16S rRNA特異性引物，以病原菌DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。由圖3可知，PCR產(chǎn)物大小1 521 bp，與預(yù)期大小一致。由圖4可知，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)與GenBank登錄的金黃色葡萄球菌16S rRNA(NR_075000)有2個(gè)核苷酸的差異，證明分離的病原菌為金黃色葡萄球菌。

2.5 病原菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

參照美國(guó)臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)1994年制定的抗生素敏感度判斷標(biāo)準(zhǔn)(NCCLS1994)判斷抑菌結(jié)果。抑菌圈直徑>15 mm 為高敏感度抑菌作用，用“+++”表示；10 mm<抑菌圈直徑<15 mm為中敏感度抑菌作用，用“++”表示；抑菌圈直徑<10 mm為低敏感度抑菌作用，用“+”表示；抑菌圈直徑<5 mm的為無(wú)抑菌作用，用“-”表示。

由表3可知，分離得到的葡萄球菌對(duì)萬(wàn)古霉素和頭孢噻吩敏感度高，對(duì)慶大霉素、四環(huán)素、青霉素為中度敏感，對(duì)于四環(huán)素和諾氟沙星敏感度低，而對(duì)于環(huán)丙沙星不敏感。

3 討論

3.1 分離培養(yǎng)基的選擇

從不同的基質(zhì)中分離葡萄球菌時(shí)，據(jù)葡萄球菌的生長(zhǎng)環(huán)境條件以及它在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的情況進(jìn)行培養(yǎng)基的組分選擇[5]。對(duì)于葡萄球菌的分離，多數(shù)人選擇有色培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)。本試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基是普通培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)菌)，而一些常見的病原菌也可以在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，如鏈球菌、大腸桿菌等在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但鏈球菌生長(zhǎng)差，有時(shí)不生長(zhǎng)。大腸桿菌雖然生長(zhǎng)旺盛，但是它的菌落大小和形態(tài)與葡萄球菌是完全不同的，因此降低了分離的難度。

3.2 細(xì)菌的分離鑒定

細(xì)菌的分離鑒定方法很多，可以是常規(guī)的生化鑒定，也可以是分子生物學(xué)鑒定，包括DNA測(cè)定、PCR技術(shù)、血清鑒定等。得益于現(xiàn)在技術(shù)的發(fā)達(dá)，較多的人是采用分子鑒定方法，利用分子鑒定能更快速地鑒定出結(jié)果[6]。本試驗(yàn)是用的常規(guī)生化鑒定方法結(jié)合分子生物學(xué)方法，能快速準(zhǔn)確鑒定出分離的病原菌。

表3 藥敏試驗(yàn)抑菌圈的平均直徑

注：直徑長(zhǎng)度用mm表示。

3.3 分離菌的耐藥性

根據(jù)所查的資料，劉軍等是用菌株數(shù)來(lái)表示該菌對(duì)各種藥敏片的耐藥性，他們?cè)囼?yàn)的結(jié)果是青霉素、四環(huán)素的耐藥性較差，本研究是用抑菌圈表示各種藥片對(duì)該菌的敏感程度，根據(jù)抑菌圈的大小判斷可知，青霉素和四環(huán)素的抑菌圈較小，表示耐藥性較強(qiáng)；諾氟沙星和環(huán)丙沙星的抑菌圈最小，耐藥性最差，由此可見該細(xì)菌對(duì)于這幾種藥已經(jīng)產(chǎn)生了抗性[7-8]。為了在今后的治療中不讓菌株產(chǎn)生抗藥性，應(yīng)擴(kuò)大抗生素應(yīng)用的廣譜性，抗生素之間試行交叉使用。本研究結(jié)果說(shuō)明在不同地區(qū)葡萄球菌對(duì)各種抗生素的抗性不同，耐藥性也是有差別的，研究結(jié)果可以為當(dāng)?shù)仡A(yù)防奶牛乳房炎的發(fā)生與流行奠定基礎(chǔ)[9-10]。

本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定方法，再根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》鑒定出從牛奶中分離出來(lái)的葡萄球菌，并根據(jù)各種生理生化試驗(yàn)鑒定出它是致病性金黃色葡萄球菌。根據(jù)本試驗(yàn)藥敏片產(chǎn)生的抑菌圈大小可知，萬(wàn)古霉素和頭孢噻吩的抑菌圈最大，平均在15 mm以上，對(duì)細(xì)菌的敏感度高；慶大霉素、紅霉素和青霉素的抑菌圈在10～15 mm之間，敏感度中；四環(huán)素和諾氟沙星的抑菌圈在5～10 mm 之間，敏感度低；環(huán)丙沙星的抑菌圈在5 mm以下，對(duì)細(xì)菌不敏感。

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