齊文武，陳曉云，鄭世茂，龐 欣

(北京東方紅航天生物技術(shù)股份有限公司空間誘變研究中心，北京 101400)

紅曲為藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材，以大米為原料經(jīng)固體發(fā)酵制得，被廣泛應(yīng)用于食品著色、釀酒以及中藥等[1-4]。近年來，紅曲霉的活性代謝產(chǎn)物洛伐他汀受到大家的廣泛關(guān)注。1979年，日本學(xué)者Endo等[5]從紅曲菌中分離出抑制羥甲戊二酰輔酶A還原酶活性更高的物質(zhì)，后被稱作洛伐他汀。隨后，含有洛伐他汀的紅曲被開發(fā)成降血脂和治療心血管等疾病的新藥[6-7]。目前，紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的生產(chǎn)工藝仍然以固態(tài)發(fā)酵更為有效[8-9]。微生物固態(tài)發(fā)酵遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及液體發(fā)酵的工藝控制精準(zhǔn)，雖然廣大科研工作者對(duì)紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的影響因素已經(jīng)有了一定的研究[10-11]，但仍然有限。影響紅曲霉發(fā)酵的因素有養(yǎng)分組成、不同階段的發(fā)酵溫度、培養(yǎng)時(shí)間、通氣量等。到目前為止，關(guān)于紅曲發(fā)酵過程中的通氣方式、通氣量對(duì)發(fā)酵影響的研究不夠深入，種子液培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基的封口方式如何影響紅曲的次生代謝尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用紅曲霉固體發(fā)酵的方式，在發(fā)酵溫度、前體物質(zhì)、初始pH、接種量和培養(yǎng)基含水率相同的前提下[12]，研究在種子液及固體培養(yǎng)過程中，不同封口方式對(duì)發(fā)酵過程中及最終產(chǎn)物中洛伐他汀含量的影響，通過洛伐他汀含量的高低確定最適封口組合方式，進(jìn)而優(yōu)化紅曲發(fā)酵的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 所用菌種為本公司制備保存的菌種。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基材料 色譜級(jí)甲醇、無水乙醇、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、葡萄糖、酵母浸膏和大米粉等。

1.1.3 儀器設(shè)備 Waters高效液相色譜儀、雙光束紫外分光光度計(jì)、分析天平、醫(yī)用離心機(jī)、高速粉碎機(jī)、超聲波清洗機(jī)、水浴鍋、各種型號(hào)標(biāo)準(zhǔn)篩等。

1.2 發(fā)酵方法

1.2.1 接種 將保藏菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于種子液培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)72h后接種于固體培養(yǎng)基。

1.2.2 培養(yǎng)基配制 種子液培養(yǎng)基按照物料比例準(zhǔn)確稱量，混勻，分裝，分別使用紗布、棉塞和試管膜進(jìn)行封口，做好標(biāo)記，121℃滅菌20min，冷卻至常溫后，備用。固體培養(yǎng)基按照物料比例準(zhǔn)確稱量，混勻，分裝，分別使用紗布、棉塞和試管膜進(jìn)行封口，做好標(biāo)記，121℃滅菌30min，趁熱打開培養(yǎng)基中的凝塊，冷卻至常溫后，備用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)處理 采用紗布、棉塞和試管膜3種封口方式，進(jìn)行正交試驗(yàn)(表1)。試驗(yàn)編號(hào)說明：XX表示固體培養(yǎng)基封口方式+種子液培養(yǎng)基封口方式。

表1 封口組合方式

1.2.4 發(fā)酵、烘干、粉碎 接種后的固體培養(yǎng)基經(jīng)過高溫發(fā)酵、低溫發(fā)酵得到紅曲。紅曲經(jīng)烘干、粉碎、過篩、混勻、取樣檢測(cè)。

1.3 紅曲中洛伐他汀含量的測(cè)定

1.3.1 色譜參考條件 色譜柱：C18柱 150 mm×4.6 mm×5 μm；流動(dòng)相：甲醇∶水∶磷酸=85∶15∶0.4(體積比)；波長(zhǎng)237 nm；柱溫25℃；

1.3.2 處理方法 樣品全部過100目標(biāo)準(zhǔn)篩，稱取0.1～0.2 g，置于8mL的離心管，精密加入4 mL 75%的乙醇溶液超聲處理1 h，取出，離心處理10 min，吸取上清液1 mL，加入0.5 mL的氫氧化鈉—乙醇溶液，搖勻，靜置10 min，加入0.5mL的磷酸—乙醇溶液，搖勻，靜置10 min后離心，取上清液5μL，檢測(cè)。

稱取內(nèi)酯型洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品，配制200g/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。吸取標(biāo)準(zhǔn)液1 mL，加入0.5 mL的氫氧化鈉—乙醇溶液，搖勻，靜置10 min，加入0.5mL的磷酸—乙醇溶液，搖勻，靜置10 min后離心，取上清液5μL，檢測(cè)。

1.4 紅曲中洛伐他汀含量、桔青霉素含量的測(cè)定

依據(jù)《GB/T 5009.222-2008》[14]測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同封口組合方式下發(fā)酵紅曲中洛伐他汀含量的變化

當(dāng)紅曲進(jìn)入低溫發(fā)酵階段后，從第4天開始取樣，每隔2d取樣1次，直至發(fā)酵結(jié)束，檢測(cè)不同處理方式隨發(fā)酵時(shí)間紅曲中洛伐他汀含量的變化，取樣檢測(cè)的結(jié)果見表2。高溫發(fā)酵階段(30～35℃)，菌絲快速生長(zhǎng)，生物量逐漸積累到一定階段后轉(zhuǎn)入低溫發(fā)酵。低溫發(fā)酵階段(20～25℃)，利于洛伐他汀的積累[12]，故從低溫階段開始取樣。從洛伐他汀合成量來看，當(dāng)固體培養(yǎng)基采用紗布封口，同時(shí)種子液培養(yǎng)基采用紗布或棉塞封口時(shí)，紅曲中洛伐他汀含量的增長(zhǎng)較快，洛伐他汀的產(chǎn)量最高；當(dāng)固體培養(yǎng)基和種子液培養(yǎng)基均采用試管膜封口時(shí)，紅曲中洛伐他汀增長(zhǎng)較慢，洛伐他汀的含量最低。從不同處理方式對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀的顯著性分析(表3)可以看出，在0.05的顯著性水平下，AA與AB這2種封口組合方式對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀無顯著性影響，但是與其余幾種封口組合方式相比，這2種方式可顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物中的洛伐他汀含量，而且隨著時(shí)間的推移效果更為顯著。

表2 洛伐他汀合成量 單位：mg/g

表3 不同封口方式組合對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀的影響

注：*顯著性水平為0.05

2.2 桔青霉素的檢測(cè)

9種不同封口組合方式下紅曲的發(fā)酵過程中均未檢測(cè)到桔青霉素[14]。桔青霉素是紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中重要的有害成分，說明這幾種發(fā)酵方式均是安全可靠的。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)旨在研究紗布、棉塞和試管膜這3種不同的封口組合方式對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)固體培養(yǎng)基采用紗布封口，液體培養(yǎng)基采用紗布或棉塞封口時(shí)，紅曲產(chǎn)洛伐他汀的含量最高且桔青霉素未檢出。同時(shí)可以看出，在固體培養(yǎng)基封口固定的情況下，種子液培養(yǎng)基使用棉塞或紗布封口較試管膜封口得到的發(fā)酵產(chǎn)物中洛伐他汀的含量高；而種子液培養(yǎng)基使用棉塞和紗布封口得到的發(fā)酵產(chǎn)物中洛伐他汀的含量十分接近。整體看來，在種子液培養(yǎng)基封口方式相同情況下，固體采用紗布封口得到的洛伐他汀含量較其他2種方式均高，在固體培養(yǎng)基封口方式相同情況下，種子液培養(yǎng)基采用試管膜封口得到的洛伐他汀含量較其他2種方式均低，這與不同的封口方式、透氣性不同有關(guān)系，透氣性差不利于紅曲霉的次級(jí)代謝，這與文獻(xiàn)報(bào)道的增加發(fā)酵瓶中的透氣量對(duì)高產(chǎn)MonacolinK有利是一致的[10]。

綜合分析洛伐他汀合成量，低溫前10d，洛伐他汀增長(zhǎng)迅速，之后洛伐他汀增長(zhǎng)趨勢(shì)放緩，這與研究報(bào)道相吻合[9，11]。當(dāng)固體培養(yǎng)基采用紗布封口，同時(shí)種子液培養(yǎng)基采用紗布或棉塞封口時(shí)，紅曲中洛伐他汀的長(zhǎng)速較快，洛伐他汀的產(chǎn)量最高。

4 討論

傳統(tǒng)紅曲發(fā)酵工藝由于不能有效控制通風(fēng)、溫度、濕度等重要發(fā)酵條件，所得紅曲的活性成分較低，且桔青霉素污染嚴(yán)重。紅曲發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀不僅受培養(yǎng)基組成的影響，培養(yǎng)條件對(duì)代謝產(chǎn)物洛伐他汀的產(chǎn)生也有顯著的影響，特別是通氣性，其在紅曲發(fā)酵過程中占據(jù)重要的作用[15-17]。因此，控制適當(dāng)?shù)耐饬繉?duì)紅曲發(fā)酵非常關(guān)鍵。影響固態(tài)發(fā)酵過程中通氣性的因素包括發(fā)酵裝置、裝樣、初始含水量、翻曲頻率等均有所報(bào)道，本試驗(yàn)則吸取前人的優(yōu)秀成果結(jié)合企業(yè)目前的生產(chǎn)工藝，從固體與種子液培養(yǎng)基的封口方式研究通氣條件對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀的影響。試管膜使用方便，但在長(zhǎng)期的生產(chǎn)中，筆者發(fā)現(xiàn)該封口方式洛伐他汀的產(chǎn)量一直很難有所提高，本次研究有效證明了由于試管膜的通氣性較差影響了最終的洛伐他汀含量；棉塞是傳統(tǒng)的封口方式，但由于存在易污染、難清洗等問題，在生產(chǎn)中已逐漸不再采用；紗布封口不僅通氣量是3種方式中最適宜的，而且易清洗，可重復(fù)利用，也比較符合工業(yè)化生產(chǎn)的成本控制原則，為進(jìn)一步優(yōu)化工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵條件、改善紅曲發(fā)酵工藝提供了新思路?！?/p>

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