不同基質(zhì)溶液與滲透壓對(duì)PEG沉淀血清循環(huán)免疫復(fù)合物的影響*

徐國(guó)萍，成 軍，孫長(zhǎng)貴，戴玉柱

(1.杭州江干區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，杭州 310016；2.解放軍第一一七醫(yī)院檢驗(yàn)科，杭州 310013)

血清循環(huán)免疫復(fù)合物(circulating immune complex，CIC)在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到了非常關(guān)鍵的作用，因此臨床實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)了大批關(guān)于CIC檢測(cè)的方法[1～3]。依據(jù)檢測(cè)方法的特異性，將CIC檢測(cè)方法分為特異性方法和非特異性方法兩大類[4～6]。而聚乙二醇(PEG)沉淀法既可用于非特異性的方法檢測(cè)(分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度)，也可用于特異性方法的前處理(CIC濃縮或CIC與血清基質(zhì)分離)。PEG為一種不帶電荷的直鏈大分子多糖，主要通過(guò)促進(jìn)CIC聚合成更大的凝聚物而使之被沉淀，PEG沉淀法因方法簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，在臨床實(shí)驗(yàn)室被廣泛用于病原體及血清CIC的分離與濃縮。國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)均對(duì)PEG沉淀法的溫度、離心力、時(shí)間等要素進(jìn)行了優(yōu)化和明確[5，7]，但PEG沉淀法所用溶液基質(zhì)、離子強(qiáng)度以及滲透壓的選擇對(duì)沉淀效果的影響，則未見相關(guān)報(bào)道。本文在PEG沉淀法常見的影響因素下，結(jié)合我們自主研發(fā)的特異性免疫復(fù)合物緩沖解離技術(shù)，提出了溶液基質(zhì)、離子強(qiáng)度及滲透壓對(duì)PEG沉淀法分離血清CIC的影響。具體如下：

1材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 335份五種乙肝血清標(biāo)志物模式(HBV-M)標(biāo)本來(lái)自于健康體檢者、本院住院傳染病科、浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病中心住院病人，其中100份HBV-M-1標(biāo)本(健康體檢者，陰性對(duì)照組)：HBsAg，anti-HBs，HBeAg，anti-HBe，anti-HBc均陰性；42份HBV-M-2標(biāo)本：HBsAg，HBeAg和anti-HBc陽(yáng)性，117份HBV-M-3標(biāo)本：HBsAg，anti-HBe和anti-HBc陽(yáng)性；30份HBV-M-4標(biāo)本：HBsAg，anti-HBc陽(yáng)性；46份HBV-M-5標(biāo)本：anti-HBs，anti-HBe，anti-HBc陽(yáng)性。

1.2 試劑和儀器 制備HBsAg-anti-HBsAg免疫復(fù)合物(HBsAg-CIC)，其中HBsAg純化抗原(3.0 mg/ml)購(gòu)于以色列Prospec公司；羊-抗HBsAg多克隆抗體(3.0 mg/ml)購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；聚乙二醇(PEG 6000)、硼酸(H3BO3)、硼砂(Na2B4O7)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、氯化鈉(NaCl)、氟化鈉(NaF)購(gòu)置于成都科龍化工；巴比妥鈉(C8H11N2NaO3)購(gòu)于華中海威基因有限公司；濃鹽酸(HCl)購(gòu)于蘭溪六洞山化工。上海精宏DK-8D型水浴箱，上海精科UV-721型分光光度計(jì)，德國(guó)原裝賽多利PP-50型pH計(jì)，德國(guó)艾卡C-MAG HS型磁力混勻器，德國(guó)艾本德5804 R型高速離心機(jī)，德國(guó)高能泰克osmomat 030型冰點(diǎn)滲透壓儀，美國(guó)雅培診斷i2000型化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套HBsAg檢測(cè)試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 HBsAg-抗HBsAg免疫復(fù)合物制備：在美國(guó)雅培公司i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套HBsAg試劑檢測(cè)在線性范圍內(nèi)按照合適的比例配制HBsAg-CIC，用HBV-M均陰性的混合人獻(xiàn)血員血清作為稀釋劑稀釋純化的人血HBsAg至200 IU/ml(制備的HBsAg量)，然后加入羊抗-HBsAg多克隆抗體直至游離HBsAg檢測(cè)結(jié)果<1.5 IU/ml，游離抗體<15 IU/ml為止，37℃水箱放置2 h，然后放4℃冰箱過(guò)夜，即形成穩(wěn)定的HBsAg-CIC，精確計(jì)算HBsAg終濃度為193.6 IU/ml，每升復(fù)合物制備溶液中加入0.2 ml proclin 300生物防腐劑后分裝4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 免疫復(fù)合物分離：依據(jù)參考文獻(xiàn)[5]選擇70 g/L PEG 6000沉淀劑，4℃沉淀24 h，離心力為18 009×g離心10 min，對(duì)不同基質(zhì)溶液、離子強(qiáng)度及滲透壓進(jìn)行多因素正交設(shè)計(jì)分組，各基質(zhì)溶液的配置依據(jù)專利及參考文獻(xiàn)[5，8，9]。①基質(zhì)溶液濃度：0.10 mol/L，0.15 mol/L，0.20 mol/L；②不同基質(zhì)溶液：硼酸鹽緩沖液(BB)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、巴比妥鈉-HCl緩沖液(Barbital -HCl)，Tris-HCl緩沖液；③基質(zhì)溶液滲透壓：400 mOsm/kg，500 mOsm/kg，600 mOsm/kg，700 mOsm/kg；④基質(zhì)溶液pH值：7.8，8.0，8.2，8.4。

1.3.3 免疫復(fù)合物傳統(tǒng)法(傳統(tǒng)PEG沉淀法)[10]與改良法[5](優(yōu)化后的PEG沉淀分離法)的分離結(jié)果比較：傳統(tǒng)法和改良法分離待測(cè)樣本HBsAg-CIC沉淀各兩份分別設(shè)空白管(未解離HBsAg測(cè)定值)和測(cè)定管(解離后HBsAg測(cè)定值)。分離后沉淀，按照我們自主研發(fā)的專利技術(shù)[8，9](專利號(hào)：ZL201410034039.5，ZL201410033277.4)對(duì)分離出的CIC進(jìn)行解離，解離后使用化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)游離HBsAg量，來(lái)計(jì)算免疫復(fù)合物量即解離率?？瞻讓?duì)照管未解離的游離HBsAg測(cè)定：向空白對(duì)照管中同時(shí)加入CIC抗原緩沖解離劑和CIC抗原緩沖解離中和劑，混勻后采用Abbott i2000分析儀及配套試劑檢測(cè)HBsAg，其結(jié)果作為空白值；測(cè)定管解離后的總游離HBsAg測(cè)定：向測(cè)定管中加入抗原緩沖解離劑，置42℃水浴振蕩30 min(振蕩頻率60次/min)；抗原緩沖解離中和劑，混勻后采用Abbott i2000分析儀及配套試劑2 h內(nèi)檢測(cè)HBsAg，其結(jié)果作為測(cè)定值(HBsAg-CIC=測(cè)定管HBsAg測(cè)定值-空白管HBsAg空白值)。

1.4 結(jié)果判斷 HBsAg-CIC結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 解離測(cè)定CIC中抗原結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

注：*Abbott i2000免疫分析儀的HBsAg Cutoff=0.05 IU/ml。

2結(jié)果

2.1 PEG沉淀法中不同基質(zhì)、濃度、pH值、滲透壓條件優(yōu)化 見表2。通過(guò)采用正交設(shè)計(jì)對(duì)PEG各影響因素的優(yōu)化比較發(fā)現(xiàn)：在這已知四個(gè)影響因素中，按照其對(duì)沉淀效果的影響大小依次為：溶液滲透壓>基質(zhì)溶液種類>溶液pH值>溶液濃度，通過(guò)四因素四水平的比較，得到PEG優(yōu)化后改良法的最佳分離溶液體系：0.15 mol/L，pH 8.2，500 mOsm/kg的硼酸鹽緩沖液含70 g/L PEG6000。

表2 不同基質(zhì)、濃度、pH值、滲透壓條件優(yōu)化正交設(shè)計(jì)結(jié)果

注：表中加下劃線數(shù)據(jù)為該因素中分離效果最佳的水平。

2.2 傳統(tǒng)法與改良法分離結(jié)果比較 見圖1。通過(guò)將傳統(tǒng)法與改良法的前處理結(jié)果進(jìn)行比較可知：在乙肝感染不同的HBV-M中，HBV-M2模式中的HBsAg-CIC陽(yáng)性率最高，其次為HBV-M3模式，HBV-M1的HBsAg-CIC陽(yáng)性率最低；圖中乙肝各模式下經(jīng)改良法前處理的HBsAg-CIC檢出率明顯高于傳統(tǒng)法，其中HBV-M1為不存在HBsAg-CIC，所以兩者無(wú)可比性。

由表3可知：改良法和傳統(tǒng)法同時(shí)運(yùn)用在乙肝不同模式下，改良法沉淀的HBsAg-CIC的量高于傳統(tǒng)法，且在HBV-M 2，3，4中差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.66，-12.60，均P<0.05)，另外在HBV-M 1，5模式中，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.775～-1.77，均P>0.05)。

表3 不同HBV-M模式采用傳統(tǒng)法與改良法的分離HBsAg含量比較

注：HBV-M-1：HBsAg，anti-HBs，HBeAg，anti-HBe，anti-HBc均陰性；HBV-M-2：HBsAg，HbeAg，anti-HBc陽(yáng)性；HBV-M-3：HBsAg，anti-HBe，anti-HBc陽(yáng)性；HBV-M-4：HBsAg，anti-HBc陽(yáng)性；HBV-M-5：anti-HBs，anti-HBe，anti-HBc陽(yáng)性。

圖1 不同HBV-M模式采用傳統(tǒng)法與改良法HBsAg-CIC陽(yáng)性率(%)

3討論抗原進(jìn)入機(jī)體或自身抗原刺激(抗原變性、隱蔽性抗原釋放)，能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量針對(duì)相關(guān)抗原的抗體，致使抗原與抗體形成免疫復(fù)合物[1～3]。部分抗原形成免疫復(fù)合物被清除，但在某些情況下，當(dāng)抗原在體內(nèi)持續(xù)存在或者機(jī)體清除抗原抗體復(fù)合物的功能受損時(shí)，免疫復(fù)合物可在機(jī)體的特定部位引起損害，導(dǎo)致急性炎癥、慢性炎癥、甚至變性壞死[11]。乙型肝炎在我國(guó)病毒性肝病中，患病比例最高，而且多數(shù)處于慢性化，病毒長(zhǎng)期與宿主共存，難以完全清除，其中HBsAg-CIC在乙型肝炎引起肝病發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用[12，13]。PEG沉淀法檢測(cè)免疫復(fù)合物，因其敏感度及特異度問(wèn)題，在目前實(shí)驗(yàn)室逐漸被抗抗體法、補(bǔ)體法等相對(duì)特異的方法所取代。而PEG沉淀CIC法，在臨床及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室仍然被廣泛用于各類CIC的分離及病原體核酸濃縮。本文圍繞PEG沉淀法分離血清HBsAg-CIC這一主題，對(duì)該分離方法的實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，以提高分離效果。

由表2可知，除了PEG的濃度、沉淀時(shí)間以及離心力外，本文討論的沉淀分離所受影響因素，其重要性依次為：滲透壓>基質(zhì)溶液>pH值>濃度，其中滲透壓為主要因素，提示適當(dāng)?shù)奶岣邼B透壓有助于免疫復(fù)合物的有效分離，過(guò)高或者過(guò)低則影響CIC的分離。分析原因：適當(dāng)?shù)母邏簻p少CIC處于懸浮狀態(tài)，并且可使CIC的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變有利于CIC分離。當(dāng)滲透壓過(guò)低時(shí)，懸浮狀態(tài)CIC過(guò)多導(dǎo)致最后的沉淀離心，無(wú)法將CIC沉淀完全。當(dāng)滲透壓過(guò)高時(shí)，CIC及其內(nèi)部的抗體空間結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重的改變，致使用其他特異性方法去檢測(cè)時(shí)，CIC中的檢測(cè)位點(diǎn)無(wú)法充分暴露，反而降低了檢測(cè)效果致使檢測(cè)能力下降。其次是基質(zhì)溶液，我們?cè)谶x擇不同的基質(zhì)時(shí)存在明顯的差異，其中BB緩沖液與PBS緩沖液差異小，而使用巴比妥緩沖液與Tris-HCl作為基質(zhì)溶液分離效果明顯下降，這可能是不同的基質(zhì)體系，即使是pH值一致，可其內(nèi)部的緩沖離子量不同，導(dǎo)致分離效果存在差異。pH值單獨(dú)作為影響因素和不同基質(zhì)溶液是分不開的，不同的pH值在某種程度上也就決定了其緩沖能力的大小。溶液濃度影響最小，本文研究的均為緩沖體系，所以在一定的濃度范圍內(nèi)變化，基質(zhì)溶液仍然呈現(xiàn)緩沖體系。

由表3和圖1可知在乙肝不同模式下，HBsAg-CIC的陽(yáng)性率不同，其中陽(yáng)性率最高的是HBV-M2(HBsAg，HbeAg，anti-HBc陽(yáng)性)，最低的是HBV-M1 (HBsAg，anti-HBs，HBeAg，anti-HBe，anti-HBc均陰性)，改良法的陽(yáng)性率要高于傳統(tǒng)法，另外改良法(HBV-M 2，3，4)分離的HBsAg-CIC量要高于傳統(tǒng)法，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在HBV-M5中因?yàn)楸狙芯渴占臉颖纠龜?shù)少，所以差異未能比較出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，由此說(shuō)明在HBV疾病發(fā)生發(fā)展的不同階段其HBsAg-CIC含量不盡相同，其形成機(jī)制和致病機(jī)理還不十分明確，有待下一步研究證明。

綜上所述，PEG沉淀免疫復(fù)合物法，不僅要考慮到PEG濃度、離心力以及放置時(shí)間的因素，同時(shí)要考慮基質(zhì)溶液滲透壓、基質(zhì)溶液種類、不同pH值和基質(zhì)溶液濃度等因素。改良法PEG沉淀效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法，為進(jìn)一步研究HBsAg-CIC在HBV感染不同階段的致病機(jī)理提供了一個(gè)可靠的技術(shù)手段，同時(shí)對(duì)于各類病原體或自身抗原所致疾病中形成的CIC研究工作提供了新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] Murphy K，Travers P，Walport M．Janeway’s immunobiology[M]．8th Ed．Garland Publishing Inc，2012．

[2] Iwasaki A，Medzhitov R．Control of adaptive immunity by the innate immune system[J]．Nat Immunol，2015，16(4)：343-353．

[3] Rojko JL，Evans MG，Price SA，et al．Formation，clearance，deposition pathogenicity and identification of biopharmaceutical-related immune complexes：review and case studies[J]．Toxicol Pathol，2014，42(4)：725-764．

[4] Takeda K，Maruki M，Yamagaito T，et al．Highly sensitive detection of hepatitis B virus surface antigen by use of a semiautomated immune complex transfer chemiluminescence enzyme immunoassay[J]．J Clin Microbiol，2013，51(7)：2238-2244．

[5] Dai Y，Hu Z，Chen Y，et al．A novel general and efficient technique for dissociating antigen in circulating immune complexes[J]．Electrophoresis，2018，39(2)：406-416．

[6] Moore TL．Immune complexes in juvenile idiopathic arthritis[J]．Front Immunol，2016(7)：177．

[7] Reshetnyak T，Alexandrova EN，Seredavkina NV，et al．AB0434 antibody to dsdna (anti-dsdna)，circulating immune complex (cic) in systemic lupus erithematosus (sle) and antiphospholipid syndrome (aps)[J]．Ann Rheum Dis，2013，72(suppl 3)：A921．

[8] 成 軍，戴玉柱，閆 利，等．一種免疫復(fù)合物緩沖解離劑及其應(yīng)用，中國(guó)專利：ZL 2014 10033277．4[P]．2016-4-6．

Cheng J，Dai YZ，Yan L，et al．An immune complex dissociation buffer agent and its application，CN：ZL 2014 10033277．4[P]．2016-4-6．

[9] 成 軍，孫長(zhǎng)貴，戴玉柱，等．一種用于免疫復(fù)合物緩沖解離劑的CIC復(fù)溶劑，中國(guó)專利：ZL2014100340 39．5[P]．2016-4-6．

Cheng J，Sun CG，Dai YZ，et al．An immune complex dissociation buffer agent CIC complex solvent，CN：ZL201410034039．5[P]．2016-4-6．

[10] 管曉龍，王海永，周 瑩，等．類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清免疫復(fù)合物的質(zhì)譜鑒定與差異蛋白分析[J]．醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2017，30(5)：495-501．

Guan XL，Wang HY，Zhou Y，et al．Differentially expressed proteins in serum immune complexes of rheumatoid arthritis：Analysis by mass spectrometry[J]．Journal of Medical Postgraduates，2017，30(5)：495-501．

[11] Sobenin IA，Salonen JT，Zhelankin AV，et al．Low density lipoprotein-containing circulating immune complexes：Role in atherosclerosis and diagmostic value[J]．Bio Med Res Int，2014(2014)：205697．

[12] Yao X，Wang X，Zhao C，et al．Transcriptional analysis of immune-related genes in dendritic cells from hepatitis B surface antigen (HBsAg)-positive transgenic mice and regulation of Fc gamma receptor IIB by HBsAg-anti-HBs complex[J]．J Med Virol，2011，83(1)：78-87．

[13] Takeda K，Maruki M，Yamagaito T，et al．Highly sensitive detection of hepatitis B virus surface antigen by use of a semiautomated immune complextransfer chemiluminescence enzyme immunoassay [J]．J Clin Microbiol，2013，51(7)：2238-2244．