王 西,沈 毅,張亞東,王冬梅
(四川省古藺郎酒廠有限公司,四川古藺646500)
醬香型白酒是中國(guó)白酒的重要香型,采用“四高兩長(zhǎng)”“二九八七”的獨(dú)特釀造技術(shù),所釀造的白酒具有“醬香突出,幽雅細(xì)膩,酒體醇厚,回味悠長(zhǎng),空杯留香持久”的風(fēng)格特點(diǎn)。隨著人們物質(zhì)生活水平的提高,對(duì)于白酒釀造技術(shù)以及白酒風(fēng)味需求也越來越高,而白酒功能微生物的研究對(duì)提高白酒品質(zhì)具有重要價(jià)值。芽孢桿菌,包括嗜熱芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及地衣芽孢桿菌等都有較強(qiáng)的水解淀粉和蛋白質(zhì)的能力,是醬香型白酒的風(fēng)味物生成和風(fēng)格形成的重要菌類[1]。由于芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶與淀粉酶,其水解原料形成豐富的前體環(huán)境,有利于風(fēng)味物質(zhì)的生成[2]。枯草芽孢桿菌屬于芽孢桿菌科細(xì)菌,為革蘭氏陽性嗜熱桿菌,已經(jīng)證實(shí)這類嗜熱芽孢微生物能產(chǎn)乙偶姻[3-4]、四甲基吡嗪[5]和呋喃扭爾。醬香型白酒生產(chǎn)本質(zhì)上是釀酒微生物代謝及所產(chǎn)酶催化各種酶促反應(yīng)的過程,而“高溫堆積”則為醬酒生產(chǎn)提供了各種復(fù)雜的微生物和酶,富集的主要是酵母,同時(shí)細(xì)菌、霉菌也明顯增多[6]。醬香型三次酒產(chǎn)酒量一般能達(dá)到10%左右,屬于“大回酒”高產(chǎn)酒時(shí)段,對(duì)整批酒質(zhì)有著極其重要的作用。本研究利用從高溫大曲中分離得到的枯草芽孢桿菌,制成菌粉分別添加至醬香型二次酒高溫堆積前和入池發(fā)酵前的糟醅中,模擬醬香型白酒生產(chǎn),入池發(fā)酵40 d,以提高三次酒的品質(zhì),同時(shí)考察不同添加方式、添加量對(duì)糟醅和酒質(zhì)的影響。
菌株:從LJ高溫大曲中篩選的枯草芽孢桿菌G2017-12。
試劑及耗材:所用糟醅、高溫大曲、稻殼均來源于四川省古藺郎酒廠有限公司。豆粕粉(粉碎過60目篩)、玉米黃粉、K2HPO4等均為食品級(jí)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
儀器設(shè)備:StableFlex纖維頭(50/30 μmDVB/Carboxen/PDMS)、57550-U手動(dòng)萃取手柄,美國(guó)Supelco公司;7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,安捷倫科技有限公司;1.5 t地上衡,蘇州太恒稱重設(shè)備有限公司;高精度電子分析天平,上海精科儀器有限公司;SCQ-2201系列超聲波清洗機(jī),上海聲彥超聲波儀器有限公司;TDL-50臺(tái)式低速離心機(jī),常州梅香儀器有限公司;FJG微生物培養(yǎng)罐(150 L),溫江工大輕工機(jī)械有限公司;小型噴霧干燥機(jī)GG-6000Y,上海桂戈實(shí)業(yè)有限公司。
1.2.1 功能微生物種子培養(yǎng)
將搖瓶培養(yǎng)過的枯草芽孢桿菌移至微生物培養(yǎng)罐擴(kuò)大培養(yǎng)。準(zhǔn)確稱量豆粕粉10 kg、玉米黃粉2 kg、K2HPO41 kg、功能菌種2.5 kg和適量蒸餾水添加到滅菌后的培養(yǎng)罐(滅菌操作:通熱蒸汽對(duì)罐體升溫,當(dāng)溫度達(dá)120℃、壓強(qiáng)0.11 MPa時(shí)保持溫度和壓力20 min),制成100 L的培養(yǎng)液[7-9]。
發(fā)酵條件:發(fā)酵溫度(35±1)℃,通氣量25~40m3/h,攪拌速度150~160 r/min,通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制發(fā)酵過程的溶氧在20%以上,罐壓0.02~0.04 MPa,發(fā)酵過程中pH值保持在6.5~7.5。培養(yǎng)時(shí)間約24 h,最適放罐時(shí)間為26~28 h[10-11]。制成的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液經(jīng)噴霧干燥[12-14]成粉末備用。
1.2.2 醬香型二次酒高溫堆積與入池發(fā)酵
醬香型二次酒開窖、取酒、攤晾、撒曲后,模擬醬香型白酒工藝進(jìn)行高溫堆積和入池發(fā)酵。將備好的枯草芽孢桿菌菌粉在高溫堆積前分別按0.5‰、1‰、4‰、7‰、10‰的接種比例添加至700 kg(1甑)糟醅中(此為高溫堆積前添加組,簡(jiǎn)稱“堆積組”),以不接入功能菌粉的糟醅為空白對(duì)照(簡(jiǎn)稱“空白組”),同時(shí)另取5個(gè)堆在堆積后、入池發(fā)酵前添加0.5‰、1‰、4‰、7‰、10‰的接種比例至700 kg糟醅作比較(此為入池發(fā)酵前添加組,簡(jiǎn)稱“入池組”),其中菌粉采用適量36℃溫水活化30 min后使用。操作同時(shí)進(jìn)行,各組糟醅做標(biāo)記,操作具體要求如下。
堆積前,將初始糟醅攪拌均勻,再分成若干小堆,每堆準(zhǔn)確稱量700 kg,單獨(dú)起堆,根據(jù)要求分成“堆積組”“入池組”“空白組”,同時(shí)操作,糖化時(shí)間控制為5 d,并以單獨(dú)一口窖池發(fā)酵,全過程模擬醬香型白酒生產(chǎn);然后入池時(shí)將各組的每堆(700 kg)糟醅分別入池發(fā)酵,采用編織布隔離區(qū)分,并做好標(biāo)記,用窖泥封窖,發(fā)酵時(shí)間為40 d。高溫堆積前、入池時(shí)、發(fā)酵40 d后立即測(cè)定各組糟醅的水分、酸度、蛋白質(zhì)和四甲基吡嗪含量。當(dāng)發(fā)酵期滿,開窖取醅,將“堆積組”“空白組”“入池組”分別上甑蒸餾,對(duì)蒸餾得到的酒樣進(jìn)行頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction)結(jié)合GC-MS分析,同時(shí)對(duì)各組酒樣進(jìn)行感官鑒定。
1.2.3 糟醅及酒樣中香味物質(zhì)測(cè)定[15-17]
本研究香味物質(zhì)以特征香味物質(zhì)四甲基吡嗪(2,3,5,6-tetramethyrazine,TTMP)為參考目標(biāo),采用頂空固相微萃取(HS-SPME)結(jié)合GC-MS分析糟醅和酒樣中揮發(fā)性成分及吡嗪類物質(zhì)的含量。
樣品處理:取糟醅20 g,研磨充分后加入40 mL蒸餾水浸泡12 min,然后攪拌加超聲波處理40 min,離心取上清液6 mL于15 mL萃取瓶中,加入2 g NaCl(酒樣稀釋10倍,則直接取6 mL于15 mL萃取瓶中,不加NaCl)。插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS StableFlex纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器,在60℃左右頂空萃取45 min取出,快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(溫度250℃)中,熱解吸4 min進(jìn)樣。采用全掃描模式對(duì)醬香型三次酒酒樣和糟醅中揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)。
氣相色譜條件:色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm),彈性石英毛細(xì)管柱,柱溫35℃(保持5 min),以4℃/min升溫至135℃,再以8℃/min升溫至180℃保持5 min,運(yùn)行時(shí)間43 min;汽化室溫度250℃;載氣為高純氦(He)(99.999%);柱前壓7.62 psi,載氣流速0.8 mL/min;分流進(jìn)樣,分流比為20∶1;溶劑延遲時(shí)間2 min。
質(zhì)譜條件:電子電離源(electron ionization,EI),離子源溫度230℃,接口溫度250℃。
定性定量方法:采用選擇離子掃描模式對(duì)四甲基吡嗪的4個(gè)特征離子進(jìn)行掃描。根據(jù)峰面積與含量成正比的關(guān)系,用GC-MS聯(lián)用儀計(jì)算其峰面積對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值,根據(jù)已建立的四甲基吡嗪響應(yīng)值-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到糟醅中四甲基吡嗪含量。
1.2.4 蛋白質(zhì)、水分、酸度含量的測(cè)定
蛋白質(zhì)測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的方法測(cè)定[18];水分測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》中的方法測(cè)定[19];酸度測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB 5009.239—2016《食品酸度的測(cè)定》中方法測(cè)定[20]。
本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)“堆積組”“入池組”“空白組”高溫堆積前、入池與出池時(shí)糟醅的理化指標(biāo)(蛋白質(zhì)含量、水分、酸度、四甲基吡嗪)進(jìn)行了測(cè)定,詳細(xì)結(jié)果見表1、圖1、圖2。
由表1可知,接種量對(duì)發(fā)酵后糟醅的水分、酸度影響不明顯,“堆積組”糟醅出池后最高水分42.57%,而最低水分為42.23%,最高酸度0.93H+mmol/10 g,最低酸度 0.84H+mmol/10 g。同等添加量條件下,“堆積組”發(fā)酵后糟醅的蛋白質(zhì)消耗量、四甲基吡嗪生成量比“入池組”多?!岸逊e組”糟醅中最高四甲基吡嗪含量為6.98 μg/g,而“入池組”只有6.02 μg/g。添加功能性微生物枯草芽孢桿菌在白酒糟醅中,其特征香味物質(zhì)的提升強(qiáng)度跟其添加的方法有著密不可分的聯(lián)系,添加菌粉在糟醅堆積前會(huì)使堆積過程中功能性微生物大量繁殖和代謝,生成香味物質(zhì)和香味前體物質(zhì)。
由圖1可知,“堆積組”發(fā)酵后糟醅中殘留蛋白質(zhì)含量隨接種菌粉的數(shù)量增加而總體呈下降趨勢(shì),從表1可知,在同樣的菌粉添加量時(shí),殘留蛋白含量基本上低于“空白組”和“入池組”。蛋白質(zhì)減少可能與加入的枯草芽孢桿菌自身生長(zhǎng)消耗及代謝利用部分蛋白質(zhì)將其轉(zhuǎn)化成四甲基吡嗪等風(fēng)味物質(zhì)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的中性蛋白酶與其他微生物產(chǎn)生的蛋白酶協(xié)同作用,能降解復(fù)雜蛋白質(zhì),對(duì)提高出酒率及酒的品質(zhì)有積極作用。
堆積前的糟醅中四甲基吡嗪含量較低,為0.02 μg/g。從圖2可看出,“堆積組”出池后,最低的四甲基吡嗪含量為2.34 μg/g,當(dāng)接種量達(dá)到4‰時(shí),其四甲基吡嗪含量達(dá)到最高,為6.98 μg/g,是空白組1.53 μg/g的4.56倍。其次為7‰接種量的“堆積組”,含量為6.62 μg/g。因此選擇接種量為4‰進(jìn)行后續(xù)分析。
表1 不同接種量與接入方式的糟醅理化指標(biāo)
圖1 接種量對(duì)“堆積組”糟醅中蛋白質(zhì)含量的影響
圖2 接種量對(duì)“堆積組”糟醅中四甲基吡嗪含量的影響
將“空白組”(接種量為0)、“堆積組”(4‰)、“入池組”(4‰)的酒樣進(jìn)行GC-MS成分分析,具體參數(shù)見表2。
由表2可見,“空白組”酒樣中共檢到42種物質(zhì),醇類物質(zhì)9種,酯類物質(zhì)15種,醛類物質(zhì)2種,酮類物質(zhì)3種,酸類物質(zhì)6種,酚類化合物2種,芳香族及雜環(huán)類化合物5種。其中乳酸乙酯、乙酸乙酯相對(duì)含量較高,吡嗪類及前體物質(zhì)含量較低。
“堆積組”酒樣中共檢測(cè)出50種物質(zhì),醇類物質(zhì)9種,酯類物質(zhì)18種,醛類物質(zhì)3種,酮類物質(zhì)3種,酸類物質(zhì)6種,酚類化合物3種,芳香族及雜環(huán)類化合物8種。含量最多的是乳酸乙酯,相對(duì)百分含量為1.635%,檢測(cè)到醬香風(fēng)味代表物質(zhì)有糠醛、吡嗪和糠醇等,其中2,3,5,6-四甲基吡嗪相對(duì)百分含量為0.037%,是“空白組”的3.08倍,三甲基吡嗪為0.008%,而“空白組”未檢測(cè)出。
“入池組”酒樣中共檢測(cè)出48種,醇類物質(zhì)9種,酯類物質(zhì)17種,醛類物質(zhì)3種,酮類物質(zhì)3種,酸類物質(zhì)6種,酚類化合物3種,芳香族及雜環(huán)類化合物7種。其中2,3,5,6-四甲基吡嗪相對(duì)百分含量為0.024%,是“空白組”的2倍。
“堆積組”的酒樣中檢測(cè)出物質(zhì)種類多于“入池組”“空白組”;“堆積組”中的四甲基吡嗪及前體物質(zhì)3-羥基-2-丁酮(乙偶姻)相對(duì)含量分別為0.037%、0.105%,比“空白組”“入池組”高;“堆積組”中正丙醇、正丁醇、異戊醇、正己醇等高級(jí)醇相對(duì)含量較“空白組”低。
各組酒樣分別送于專業(yè)的品酒師進(jìn)行暗評(píng),評(píng)價(jià)方法參照《郎酒醬香原酒質(zhì)量驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)》,各組酒品評(píng)結(jié)果詳見表3。
表2 各組酒樣揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果
由表3可以看出,“堆積組”的酒樣香味、口感均優(yōu)于“入池組”“空白組”的酒樣。
表3 各組的酒樣感官品評(píng)表
從高溫大曲中分離得到的枯草芽孢桿菌,通過小型培養(yǎng)罐擴(kuò)大培養(yǎng)后,干燥成菌粉,模擬醬香白酒生產(chǎn)工藝進(jìn)行應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,不同接種量對(duì)糟醅存在影響,發(fā)現(xiàn)“堆積組”接種量為4‰時(shí)效果最佳,所得糟醅中四甲基吡嗪含量較高;接種方式上,堆積糖化前添加所產(chǎn)酒的香味物質(zhì)種類、特征香味含量、酒體感官質(zhì)量均優(yōu)于入窖前添加。