徐濤 秦博 王曉麗

【摘 要】氨基酸分析在重組蛋白質(zhì)類生物制品的質(zhì)量控制中發(fā)揮著重要作用，為重組蛋白的結(jié)構(gòu)確證和功能研究提供重要的一局?；诖?，文章對(duì)一種多肽藥進(jìn)行了氨基酸成分實(shí)驗(yàn)研究，希望為相關(guān)行業(yè)人員提供一些借鑒。

【關(guān)鍵詞】氨基酸分析；重組蛋白；生物制品；質(zhì)量控制

生命科學(xué)的不斷發(fā)展使人們發(fā)現(xiàn)了更多具有重要功能蛋白質(zhì)分子，在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的重組蛋白藥物具有副作用小、用量少、藥效強(qiáng)的特點(diǎn)，在疾病治療和預(yù)防方面發(fā)揮著重要的作用。

一、實(shí)驗(yàn)材料和方法

本文檢測(cè)了一種含有20個(gè)氨基酸的多肽藥，具體檢測(cè)方法如下。

（一）條件參數(shù)：

儀器：高壓液相色譜儀（HPLC）

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（如：沃特世Xbridge（多肽）BEHC185微米粒徑4.6毫米的內(nèi)徑×250毫米的長(zhǎng)度）；

洗脫速度：每分鐘1.0毫升；

分析波長(zhǎng)：設(shè)置在248納米；

色譜柱溫度：設(shè)置在37℃；

進(jìn)樣體積：10μl。

洗脫液A：稱取11.5g無(wú)水醋酸鈉固體，加入去離子水溶解，再加入乙二胺四乙酸二鈉溶液1ml和（C2H5）3N溶液2.4ml，再利用H3PO4調(diào)溶液pH值至4.95，最后加去離子水至1000ml。

洗脫液B：乙腈（HPLC級(jí)）、超純水（60∶40）

梯度淋洗方式如下：

（二）樣品溶液配制

對(duì)照品溶液：精密稱定門冬氨酸（Asp）的對(duì)照品83.17毫克，谷氨酸（Glu）的對(duì)照品92.17毫克，精氨酸（Arg）的對(duì)照品108.68毫克，脯氨酸（Pro）的對(duì)照品72.69毫克，酪氨酸（Tyr）的對(duì)照品112.98毫克，亮氨酸（Leu）的對(duì)照品81.95毫克，異亮氨酸（Ile）的對(duì)照品81.99毫克，苯丙氨酸（Phe）的對(duì)照品103.53毫克，甘氨酸（Gly）的對(duì)照品47.13毫克，加0.1mol/L鹽酸溶解并定溶于250ml量瓶中。然后將100μl該溶液置進(jìn)樣瓶中，加入700μl硼砂緩沖溶液和200μl衍生化試劑溶液，混勻后，放入55℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，待充分反應(yīng)10分鐘后，取出并放置至室溫，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液：精密稱取10.0mg本品，將其放置在裂解瓶中，然后加入5ml濃度為6mol/L的鹽酸，并充入一定質(zhì)量氮?dú)饷荛]保護(hù)，將裂解瓶放置于120℃溫度條件下反應(yīng)24小時(shí)，然后將其取出放置至室溫，用NaOH中和HCl，調(diào)pH為8～10之后，再將溶液轉(zhuǎn)移到容量為50ml量瓶中，并用去離子水定容。精密移取100μl置進(jìn)樣瓶中，加入700μl硼砂緩沖溶液和200μl已配制好的衍生化試劑溶液，混勻后，放入55℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，反應(yīng)10分鐘后，取出放置至室溫，作為供試品溶液

（三）氨基酸測(cè)定

將已經(jīng)配制好的對(duì)照品溶液精密量取10l注入HPLC，按此操作連續(xù)進(jìn)樣3針，記錄氨基酸色譜圖并測(cè)量峰面積，3針?lè)迕娣e的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)控制在≤2.0%以內(nèi)。然后精密量取供試品溶液10l并注入高壓液相色譜儀中，按此操作連續(xù)進(jìn)樣2針，記錄色譜圖，并計(jì)算樣品中各氨基酸的摩爾數(shù)，并以酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸的相對(duì)摩爾比為1，分別計(jì)算其他氨基酸的相對(duì)摩爾比，取其平均值。其中氨基酸的摩爾數(shù)計(jì)算公式：

（式中：Ai-----供試品溶液中氨基酸的峰面積；A-----對(duì)照品溶液中氨基酸峰面積的平均值；C-----氨基酸對(duì)照品的濃度。（單位：mmol/ml））。

（四）建立快速氨基酸測(cè)序

1.Edman降解第1輪反應(yīng)

第一，將50ul1%的PITC-50%吡啶溶液加入到1號(hào)樣品中，在旋轉(zhuǎn)儀上混合均勻后充入氮?dú)狻?/p>

第二偶合：將1號(hào)樣品管充氮10s，將管塞塞進(jìn)，混合均勻后，將樣品管放置在溫度為50℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)20min。需要注意的在反應(yīng)過(guò)程要不時(shí)搖動(dòng)樣品管，在反應(yīng)結(jié)束后取出，立即置于冰水浴中冷卻。

第三，初洗：向偶合后的樣品管加入500ml庚烷：乙酸乙酯（10∶1，V/V），然后充入一定質(zhì)量的氮?dú)饷荛]保護(hù)，將管塞蓋緊并將管內(nèi)溶液搖勻，洗滌一次。洗滌后離心機(jī)（3500rpm）離心3分鐘，然后用滴管將上層的有機(jī)相移走，將剩下的水相層進(jìn)行真空干燥或者用氮?dú)鈱⑵浯蹈伞?/p>

第四，復(fù)洗：用500ml庚烷：乙酸乙酯（2∶1，V/V）洗滌一次，在每次洗滌過(guò)后，采用離心機(jī)（3500rpm）離心3分鐘，用滴管將上層的有機(jī)相移走，將剩下的水相層進(jìn)行真空干燥或者用氮?dú)鈱⑵浯蹈伞?/p>

第五，抽提PTC-aa：將裂解后的樣品置于冰浴中，向樣品管中加入50ul5%的吡啶溶液（蒸餾水），混勻。使混合物完全溶解。用250ml冷水飽和的醋酸丁酯抽提3次。每次抽提過(guò)程均需充氮?dú)?，采用離心機(jī)（3500rpm）離心3分鐘。合并3次的上層有機(jī)相，真空干燥，保存并標(biāo)記為“PTC-aa1”。下層水相真空干燥后可以開始下一輪Edman降解。

2.Edman降解第2輪反應(yīng)

第一，將②號(hào)樣品加入1中，再加入100ul1%的PITC-50%吡啶溶液，充氮?dú)?，在旋轉(zhuǎn)混合儀上混勻。

第二，偶合：在1號(hào)樣品管充入10s氮?dú)猓w緊管塞并搖勻，然后將樣品管置于50℃的恒溫水浴鍋中保溫反應(yīng)20min。反應(yīng)途中要不時(shí)搖動(dòng)，待反應(yīng)結(jié)束后將樣品管去除放置在冰水浴中冷卻。

第三，初洗：向偶合后的樣品管加入500ml庚烷：乙酸乙酯（10∶1，V/V），充入一定質(zhì)量的氮?dú)?，蓋緊管塞并搖勻，洗滌一次。洗滌后采用離心機(jī)（3500rpm）離心3分鐘，用滴管將上層的有機(jī)相移走，將剩下的水相層進(jìn)行真空干燥或者用氮?dú)鈱⑵浯蹈伞?/p>

第四，復(fù)洗：用500ml庚烷：乙酸乙酯（2∶1，V/V）洗滌一次，每次洗滌后采用離心機(jī)（3500rpm）離心3分鐘，利用滴管將上層的有機(jī)相移走，將剩下的水相層進(jìn)行真空干燥或者用氮?dú)鈱⑵浯蹈伞?/p>

第五，抽提PTC-aa：將裂解后的樣品置于冰浴中，向樣品管中加入50μl5%的吡啶溶液（蒸餾水），混勻。使混合物溶解。用250ml水飽和的醋酸丁酯抽提3次。每次抽提均需充氮?dú)猓捎秒x心機(jī)（3500rpm）離心3分鐘。合并3次上層有機(jī)相，真空干燥，保存并標(biāo)記為“PTC-aa2”。下層水相層蒸干后可以開始下一輪Edman降解。

3.Edman降解第3、4......N輪反應(yīng)即重復(fù)Edman降解第1、2輪反應(yīng)

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

本次實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜儀測(cè)定了多肽藥物中的氨基酸成分，并通過(guò)相對(duì)摩爾比計(jì)算得出本樣品中含有精氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸分別在0.80～1.20之間，含天冬氨酸、苯丙氨酸（D-苯丙氨酸）分別在1.60～2.40之間，含脯氨酸在2.40～3.60之間，含谷氨酸在3.40～4.60之間，含甘氨酸在4.20～5.80之間，考慮到試驗(yàn)的誤差，實(shí)驗(yàn)值與理論值的偏差范圍約在±20%之內(nèi)。

三、結(jié)束語(yǔ)

總而言之，隨著基因工程技術(shù)的應(yīng)用，氨基酸分析技術(shù)也取得了很大的進(jìn)步，人們可以利用此技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造、設(shè)計(jì)和表達(dá)，從而得到各種各樣的重組蛋白，為新型生物制品的研究提供了很大的幫助，也為重組蛋白的結(jié)構(gòu)、功能等方面的研究帶來(lái)了方便。

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