許桂丹 肖樹榮 鄧益斌

【關(guān)鍵詞】乙肝病毒；乙肝；基因治療

中圖分類號(hào)：R459.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.03.025

乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染呈世界性分布，是一種以引起宿主肝細(xì)胞炎性和損壞病變?yōu)橹饕卣鞯膫魅拘约膊?。全球約有2.4億慢性乙肝病毒攜帶者（chronic hepatitis B， CHB），每年由HBV感染引起肝硬化、肝癌等嚴(yán)重病變而致患者死亡近70萬人，已成為目前全球性健康問題[1]。我國是HBV感染高發(fā)區(qū)，HBV攜帶者近億人，其中有20%～30%患者發(fā)展為肝硬化、肝癌等嚴(yán)重病變，且呈逐年遞增趨勢[2]。目前，臨床抗HBV治療的藥物主要有干擾素、核苷類似物、中草藥等。其中干擾素通過作用于細(xì)胞表面受體促使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，調(diào)節(jié)免疫功能，進(jìn)而發(fā)揮病毒抑制作用，但毒副作用大，長期使用可影響患者的造血功能；核苷類似物通過競爭抑制HBV聚合酶活性，從而阻斷病毒DNA的復(fù)制，但長期使用可引起病毒變異產(chǎn)生耐藥；而中草藥的抗病毒療效又不明確。近年來，隨著基因治療研究的不斷深入，其抗病毒作用的研究也引起了人們的廣泛關(guān)注，本文擬對反義治療、反基因治療、衣殼蛋白靶向滅活（Capsid-targeted viral inactivation，CTVI）、顯性負(fù)性突變體（Dominant negative mutants，DNM）、新型基因編輯等技術(shù)作一綜述，以期為抗HBV基因治療研究提供參考。

1HBV生物學(xué)及其感染復(fù)制周期

HBV是由3.2 kb組成、具有包膜的部分雙鏈松弛環(huán)狀DNA（relaxed circular DNA， rcDNA）嗜肝病毒，包括S、C、P和X四個(gè)開放讀碼區(qū)（open reading frame， ORF），其中S和C區(qū)是保守區(qū)，也是基因治療的理想靶位。HBV感染過程包括，①侵入：HBV與受體結(jié)合后進(jìn)入肝細(xì)胞，脫去包膜形成含有rcDNA的核心顆粒，然后進(jìn)入細(xì)胞核，在DNA聚合酶的作用下形成cccDNA。②轉(zhuǎn)錄：以cccDNA作為模板，轉(zhuǎn)錄成前基因組RNA（pregenomic RNA，pgRNA）和信使RNA（messenger RNA，mRNA）并進(jìn)入胞漿。③翻譯：pgRNA、mRNA共同作用翻譯成HBV各種蛋白，包括HBX、HBsAg（外膜蛋白）、HBeAg/HBcAg（即核殼蛋白）、DNA多聚酶等。④逆轉(zhuǎn)錄：以pgRNA為模板經(jīng)一系列酶促逆轉(zhuǎn)錄先后形成負(fù)鏈DNA，正鏈DNA，含有rcDNA的核心顆粒。⑤裝配：步驟③④中形成的各種病毒蛋白、酶和含有rcDNA的核心顆粒裝配形成完整的HBV并釋放至肝細(xì)胞外。此外部分含有rcDNA的核心顆粒再次入核補(bǔ)充cccDNA庫。HBV的感染復(fù)制周期可為基因治療靶位的選擇、定位和效果評估提供重要的理論科學(xué)依據(jù)。

2抗 HBV基因治療

2.1反義治療反義技術(shù)是根據(jù)堿基配對的原理人工設(shè)計(jì)的反義基因片段與體內(nèi)某些特定基因位點(diǎn)中的DNA或RNA互補(bǔ)，從而控制該基因的表達(dá)，阻斷相應(yīng)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生[3]。目前，HBV的反義治療主要包括反義DNA、反義RNA、核酶技術(shù)和RNA干擾（RNA interference， RNAi）。

2.1.1反義DNA早在1995年，陳常慶等[4]就對反義DNA抗HBV的抑制效果作了研究，雖然 PreS區(qū)及C區(qū)的反義DNA片段抑制效果明顯，但是硫代合成的DNA片段有一定的毒性，且毒性大小與硫代數(shù)量成正比。由于穩(wěn)定性和毒性的緣故，反義DNA在抗HBV研究上受到限制。近幾年，鎖核酸（locked nucleic acid，LNA）由于具有熱穩(wěn)定性和脂溶性好，分子雜交能力和抗核酸酶降解能力強(qiáng)以及細(xì)胞毒性低等優(yōu)勢[5]，成為核酸研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。Deng YB等[6]針對乙肝病毒保守區(qū)S、C設(shè)計(jì)反義LNA片段，觀察其對轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV復(fù)制的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反義LNA對HBV復(fù)制和表達(dá)均有較顯著的影響，單靶區(qū)S，單靶區(qū)C和雙靶區(qū)SC各組對HBsAg表達(dá)的平均抑制率分別為36.63%，31.50%和5487%，對HBV DNA復(fù)制的平均抑制率分別為2397%，21.13%和35.83%；在注射后的1、3、5 天，HBsAg的平均抑制率分別為14.40%，25.61%和3133%，HBV DNA的平均抑制率分別為1104%，19.24%和24.13%；且肝、腎功能指標(biāo)未發(fā)現(xiàn)異常，結(jié)果表明HBV S/C基因位點(diǎn)的反義LNA能較強(qiáng)地抑制轉(zhuǎn)基因小鼠HBV的復(fù)制和表達(dá)且無毒副作用，雙基因靶位抑制效果優(yōu)于單基因靶位。同樣的試驗(yàn)對前C/C雙靶區(qū)反義LNA進(jìn)行研究，再一次證明針對互補(bǔ)于保守區(qū)的LNA片段可較強(qiáng)地抑制HBV的復(fù)制且無毒副作用，且雙靶區(qū)抑制效果明顯高于單靶區(qū)[7]。反義DNA為乙肝基因治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.1.2反義RNA20多年的抗HBV反義RNA治療研究表明，它能顯著抑制HBV復(fù)制，是比較理想的基因治療策略[8～10]。反義RNA片段能干擾乙肝抗原的生成，有效抑制HBV病毒的復(fù)制，在細(xì)胞試驗(yàn)中抗原表達(dá)抑制率高達(dá)60%～75%，但是對HBV復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平影響不大[10]。篩選出有效的靶點(diǎn)十分重要，Nash等[11]設(shè)計(jì)互補(bǔ)于HBV mRNA水平上的包裝信號(hào)ε，HBs和HBx蛋白的反義RNA片段，用慢病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示針對HBs蛋白的反義RNA片段能有效抑制HBV的復(fù)制，而針對HBx蛋白的反義RNA片段則是無效的，同時(shí)慢病毒載體可以使基因片段持續(xù)表達(dá)長達(dá)4個(gè)月。Billioud等[9]的細(xì)胞和動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，特定的反義寡核苷酸能有效抑制HBV的復(fù)制，聯(lián)合使用恩替卡韋效果更佳，因此在臨床治療乙肝上可以考慮聯(lián)合用藥的方式來增強(qiáng)療效。

2.1.3核酶技術(shù)核酶技術(shù)包括核酶和脫氧核酶。核酶是指能特異性地剪切mRNA片段，從而阻斷mRNA的表達(dá)，具有催化活性的特殊反義RNA。研究表明靶向性的核酶片段能有效抑制HBV的復(fù)制[11]。Xia等[12]利用核酶針對HBV pgRNA的PreS1和表面區(qū)域設(shè)計(jì)的核酸序列，以沙門氏菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，HBV基因的表達(dá)水平抑制率高達(dá)95%，HBV DNA水平減少高達(dá)200 000倍。脫氧核酶是指能催化切割特定的RNA或DNA的酶。Hou等設(shè)計(jì)互補(bǔ)于HBV的X蛋白，S基因和C基因的10～23個(gè)不同長度的脫氧核酶片段進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)，結(jié)果能分別顯著下調(diào)HBx，HBsAg和 HBeAg的蛋白水平，有效抑制HBV病毒復(fù)制，而且細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示其對細(xì)胞未見毒副作用[13～14]。但是，由于核酸酶存在活性期短、易被破壞、價(jià)格昂貴、難分離和純化等缺點(diǎn)限制了其在抗HBV基因治療上的應(yīng)用。

2.1.4RNAi由高度保守的短雙鏈RNA誘導(dǎo)同源RNA降解，引起轉(zhuǎn)錄后特異基因的沉默現(xiàn)象稱RNAi，國內(nèi)外學(xué)者對RNAi技術(shù)在乙肝基因治療領(lǐng)域已經(jīng)做了大量研究，并且它的功能性和高效性已得到普遍認(rèn)可[15]。通過深入研究病毒進(jìn)入細(xì)胞過程的詳細(xì)機(jī)制，Verrier等[16]發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5在病毒入胞、細(xì)胞分裂和生長以及肝癌等HBV相關(guān)疾病中起重要作用，可以作為新靶點(diǎn)應(yīng)用于RNAi和其他基因治療方法的研究上?；赗NAi原理研發(fā)的ARC-520基因藥物，在mRNA水平上封閉HBV某些蛋白的表達(dá)，有望成為功能性治愈乙肝的CHB藥物，是已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的功能性治愈乙肝藥物。Schluep等[17]對54名健康志愿者進(jìn)行ARC-520安全性、耐藥性、藥代動(dòng)力學(xué)和藥物不良反應(yīng)的試驗(yàn)，評估結(jié)果良好，雖少量出現(xiàn)過敏反應(yīng)，而過敏反應(yīng)可以口服抗組胺藥物應(yīng)對。但是，ARC-520基因藥物在廣泛應(yīng)用于臨床之前，其安全性和實(shí)用性還需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和臨床結(jié)果的支持。

2.2反基因治療反基因治療技術(shù)已廣泛應(yīng)用于治療腫瘤和病毒性疾病方面的研究，但在抗HBV治療方面的研究報(bào)道較少。Deng YB等[18]針對HBV S、PreS1、PreS2等基因同聚嘌呤區(qū)設(shè)計(jì)反基因LNA片段，并觀察其對細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，互補(bǔ)于S基因同聚嘌呤區(qū)的LNA轉(zhuǎn)染hepG22.15細(xì)胞6天后，對HBV DNA復(fù)制、HBsAg、HBeAg的表達(dá)抑制率分別達(dá)52.4%，57.48%和2963%。針對HBV PreS1基因作同樣的試驗(yàn)也得到類似的結(jié)論，轉(zhuǎn)染7天后，HBV DNA復(fù)制、HBsAg及PreS1的表達(dá)受到明顯的抑制，抑制率分別為6599%，67.49%和63.88%[19]。針對PreS2的LNA序列研究中，用半乳糖配體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，7 d后對HBV DNA復(fù)制、HBsAg和PreS2抗原的表達(dá)抑制率分別達(dá)61.56%、68.18%和7282%[20]。反基因LNA有望成為新的抗病毒核酸分子藥物。

2.3衣殼蛋白靶向滅活（Capsid-targeted viral inactivation，CTVI）CTVI是通過將病毒的衣殼蛋白與核酸酶的融合蛋白靶向地導(dǎo)入至病毒顆粒內(nèi)部，使病毒核酸降解，起到抑制病毒復(fù)制的目的。Beterams等[21]研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌酶與核心蛋白的融合蛋白作用于細(xì)胞后，能干擾HBV衣殼內(nèi)病毒DNA的合成或?qū)е碌腄NA快速降解。利用CTVI構(gòu)建的核心蛋白（Core）與載脂蛋白B mRNA編輯酶多肽3C（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide，APOBEC3C，又簡稱A3C），轉(zhuǎn)染于HepG2細(xì)胞中，core-A3C可以使HBV基因組發(fā)生腺嘌呤（A）→鳥嘌呤（G）的突變急劇增多，HBV的復(fù)制受到明顯的抑制[22]。

2.4顯性負(fù)性突變體（Dominant negative mutants，DNM）等位基因中其中一個(gè)失活或突變導(dǎo)致另一個(gè)正常等位基因也喪失功能活性，都稱DNM。1994年Scaglioni等[23]對DNM應(yīng)用與乙肝基因治療研究進(jìn)行了首次報(bào)道，他們根據(jù)病毒蛋白的DNM能使野生型蛋白質(zhì)的功能失活從而能夠抑制病毒復(fù)制的原理，設(shè)計(jì)出了能使核心蛋白突變的融合蛋白，可以使HBV病毒復(fù)制的抑制率高達(dá)90%～95%。劉偉俠[24]基于顯性負(fù)性突變體原理構(gòu)建的融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN，作用HepG2.2.15細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其能抑制HBV pgRNA在核心顆粒內(nèi)的包裝，有效抑制HBV的復(fù)制，且其抑制效果與作用濃度和時(shí)間有關(guān)。然而，該策略中一些混合粒子往往存在病毒逃逸機(jī)制從而還有復(fù)制能力。

2.5新型基因編輯技術(shù)鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases， ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）和CRISPR/Cas9[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated（Cas9），CRISPR/Cas9]三大新型基因編輯技術(shù)的應(yīng)用為HBV基因治療開辟了新途徑。Winer等[25]發(fā)現(xiàn)可以利用ZFN靶向干預(yù)小鼠受精卵成功造出HBV小鼠模型，該研究也為人類其他疾病的模型構(gòu)造提供了新思路，具有重要的社會(huì)意義。Chen等[26]構(gòu)建了互補(bǔ)于HBV保守區(qū)的TALEN序列，細(xì)胞和小鼠動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示TALEN序列通過特異結(jié)合及切割病毒基因組的方式導(dǎo)致HBeAg、HBsAg、HBcAg、pgRNA和cccDNA的水平明顯降低，同時(shí)，聯(lián)合使用TALEN和α干擾素，抗HBV效果更佳。Seeger等[27]通過新一代測序技術(shù)NGS發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9能夠切割90%以上的HBV DNA，而且其編輯基因的效率比α干擾素作用高達(dá)1500倍以上，從而認(rèn)為CRISPR/Cas9是目前治療CHB達(dá)到功能滅活HBV cccDNA的最佳方法。

3問題與展望

目前，探索出完全清除HBV cccDNA達(dá)到治愈乙肝的安全、高效、特異、經(jīng)濟(jì)的藥物仍是全球乙肝治療研究人員努力的方向。乙肝基因治療的各種策略都存在自身的優(yōu)點(diǎn)和不足，反義治療的靶標(biāo)主要是mRNA，在病毒蛋白的合成上有較強(qiáng)的抑制作用，但對HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平影響甚少，容易出現(xiàn)停藥反復(fù)，與之相比，反基因治療和新型基因編輯技術(shù)有在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平上阻斷HBV的優(yōu)勢，尤其是反基因治療、TALEN和CRISPR/Cas9有清除cccDNA的潛能，但由于HBV DNA存在于細(xì)胞核中，以其為靶標(biāo)的藥物必須克服核孔障礙以提高藥物的靶向性和穩(wěn)定性。CTVI特異性不強(qiáng)且有一定的毒副作用，DNM往往還存在病毒逃逸機(jī)制，在基因治療應(yīng)用上受到一定限制。因此，乙肝的基因治療絕不是單靠某種策略就能一蹴而就，筆者認(rèn)為，要征服乙肝，需要從以下幾方面努力：①探索出特異性強(qiáng)的方法，篩選出療效顯著的基因靶位，對基因藥物的修飾方法和介導(dǎo)物質(zhì)作好評估和篩選，進(jìn)一步研發(fā)出安全性高、穩(wěn)定性好、作用持續(xù)性長、副作用小和細(xì)胞毒性低的新型強(qiáng)效藥；②多基因靶位和多手段的聯(lián)合治療方案，顯示出一定的優(yōu)越性[6，7，9，26]，是治療HBV的研究趨勢；③增加投資，促進(jìn)抗HBV的臨床基礎(chǔ)研究和基因治療的全球合作。

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