謝楚玉 綜述，簡(jiǎn)華剛 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診外科 400010)

慢性創(chuàng)面是指在可預(yù)測(cè)的時(shí)間內(nèi)(一般指1個(gè)月)仍不能通過(guò)有序的修復(fù)階段達(dá)到創(chuàng)面愈合的創(chuàng)面[1]，臨床中常見(jiàn)的慢性創(chuàng)面有糖尿病足潰瘍、壓力性潰瘍、下肢靜脈潰瘍、手術(shù)部位傷口感染、膿腫、創(chuàng)傷性潰瘍等。BESSA等[2]報(bào)道了創(chuàng)面中常見(jiàn)的細(xì)菌種類(lèi)統(tǒng)計(jì)情況為金黃色葡萄球菌37%，其次是銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)17%，奇異變形桿菌10%，大腸埃希菌6%和棒狀桿菌屬5%,其中約27.1%的創(chuàng)面中檢測(cè)為多種混合細(xì)菌感染。細(xì)菌生物膜(bacterialbiofilm，BF)的存在有助于慢性創(chuàng)面的發(fā)展，其中約60.0%慢性創(chuàng)面中檢測(cè)到了BF的存在[3]。BF的發(fā)展包括3個(gè)階段：黏附期、成熟期、分散期。分散期是生物膜發(fā)展的最后階段，生物膜中的部分細(xì)菌會(huì)恢復(fù)為浮游狀態(tài)，向周?chē)h(huán)境擴(kuò)散，逐漸在新的部位形成生物聚集體[4]。本文基于促BF的分散解離作用綜述如下。

1 生物膜的分散機(jī)制

BF形成是慢性創(chuàng)面難愈合的重要因素，細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中為適應(yīng)生存環(huán)境而吸附于創(chuàng)面表面，由細(xì)菌和其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)組成。BF形成是一種連續(xù)動(dòng)態(tài)發(fā)展過(guò)程，分散期是BF發(fā)展的最后階段，一旦生物膜中的廢物大量堆積和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗竭時(shí)，群體感應(yīng)系統(tǒng)、促降解酶和其他特殊化合物等能調(diào)節(jié)降解生物膜的細(xì)胞外多糖、細(xì)胞外蛋白質(zhì)和eDNA等，這些均可導(dǎo)致生物膜分散。生物膜分散一方面使細(xì)菌由頑固生物膜狀態(tài)恢復(fù)到相對(duì)脆弱的浮游狀態(tài)，并向周?chē)h(huán)境擴(kuò)散，逐漸在新的部位形成生物聚集體，使感染進(jìn)一步擴(kuò)散；另一方面細(xì)菌處于浮游狀態(tài)下，有利于增強(qiáng)抗生素、清創(chuàng)等傳統(tǒng)治療手段對(duì)創(chuàng)面的有效性[4]。

1.1BF分散與群體感應(yīng)系統(tǒng)BF群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorumsensing，QS)指細(xì)菌通過(guò)分泌相關(guān)信號(hào)分子，感知菌體周?chē)h(huán)境的細(xì)菌群體密度，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá),是細(xì)菌調(diào)控生命活動(dòng)的主要機(jī)制之一。近年來(lái)有研究表明，QS在調(diào)節(jié)BF的分散階段中有一定作用[5]。生物膜形成是細(xì)菌以協(xié)作的方式完成的最常見(jiàn)的過(guò)程之一，QS作為細(xì)菌協(xié)作的重要機(jī)制，廣泛存在于G-和G+菌中。QS信號(hào)分子主要包括?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acylhomoserinelactone,AHL)，呋喃酮酰硼酸(furanosylboratediesters,AI2)，順式不飽和脂肪酸(DSF家族信號(hào))和肽[6]。以P．a(chǎn)eruginosa為例，其群體感應(yīng)系統(tǒng)是由擁有兩個(gè)完整的AHL系統(tǒng)(LasⅠ/LasR和RhⅠ/RhⅠR)和喹諾酮類(lèi)信號(hào)分子系統(tǒng)(pseudomonasquinolonesignal，PQS)構(gòu)成，通過(guò)調(diào)控構(gòu)建生物膜基質(zhì)中富含葡萄糖基因pel的轉(zhuǎn)錄化合物的合成來(lái)促進(jìn)生物膜的分散；通過(guò)調(diào)控表面活性劑(鼠李糖脂等)的生成促進(jìn)生物膜的解離[6]。DIAZ等[7]在研究表面活性劑(鼠李糖脂)對(duì)枯草芽孢桿菌BBK006生物膜的破壞或抑制作用過(guò)程中，得出鼠李糖脂的產(chǎn)生受QS感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，有利于BF的分散；此外，QS還可以調(diào)控細(xì)菌胞內(nèi)第二信使c-di-GMP，c-di-GMP的增加能促進(jìn)生物膜的形成，反之則抑制生物膜的形成，更利于分散解離[8]。在金黃色葡萄球菌BF形成過(guò)程中的QS系統(tǒng)是指輔助基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)(accessorygeneregulator，Agr)，Agr系統(tǒng)由膜結(jié)合蛋白(AgrB)、AgrB修飾的前體肽(AgrD)、組氨酸蛋白激酶(AgrC)及AgrC可識(shí)別的反應(yīng)調(diào)節(jié)子(AgrA)組成的細(xì)菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[6]。Agr系統(tǒng)在金黃色葡萄球菌中激活后，能啟動(dòng)其RNAⅢ效應(yīng)分子的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控多種毒力因子的產(chǎn)生，比如調(diào)控具有表面活性劑性質(zhì)的特定類(lèi)別的分泌肽——酚可溶性調(diào)節(jié)肽(phenolsolublemodulins，PSMs)。PSM不僅可以直接影響生物膜分散，而且可以通過(guò)影響生物膜的體積、厚度、粗糙度及通道形成，進(jìn)一步調(diào)節(jié)生物膜的分散?？傊?，在生物膜分散期，細(xì)菌可利用QS系統(tǒng)影響種群的社會(huì)行為，進(jìn)而調(diào)控BF的形成或分散。然而，對(duì)于混合菌生物膜間QS系統(tǒng)的相互作用仍需進(jìn)一步研究。

1.2BF分散與降解酶

1.2.1 蛋白酶類(lèi) 細(xì)胞外蛋白質(zhì)是細(xì)胞外聚合物(extracellularpolymericsubstance，EPS)的重要組成成分，外源蛋白質(zhì)對(duì)維持和修飾EPS的能力至關(guān)重要。降解細(xì)胞外蛋白質(zhì)是降解EPS的措施之一，可促進(jìn)生物膜分散發(fā)生。金黃色葡萄球菌作為創(chuàng)面中常見(jiàn)革蘭陽(yáng)性病原體，可分泌10余種的蛋白酶，包括7種絲氨酸蛋白酶(SspA和SplA-F等)，2種半胱氨酸蛋白酶(SspB和ScpA)和1種金屬蛋白酶(Aur)，其中SspA、SspB、ScpA和Aur均被證明參與生物膜的破壞[9]。LOUGHRAN等[10]將Aur，ScpA和SspB在體外純化，并通過(guò)外源性的方式加入已建立的金黃色葡萄球菌生物膜中，分析其結(jié)果顯示均具有促進(jìn)生物膜分散的作用，且Aur是效果最明顯的。Aur是一種葡萄球菌金屬蛋白酶，可通過(guò)降解生物膜相關(guān)蛋白(biofilm-associatedprtein，Bap)和凝集因子B(clumpingfactorB，ClfB)破壞金黃色葡萄球菌生物膜[11]。

1.2.2 脫氧核糖核酸酶類(lèi)(DNase) 在許多生物膜中，細(xì)胞外DNA(eDNA)作為EPS的結(jié)構(gòu)性支架，可促進(jìn)細(xì)菌黏附、聚集。在2002年，WHITCHURCH等[12]發(fā)現(xiàn)eDNA是BF的另一重要組成部分，經(jīng)體外試驗(yàn)加入外源性脫氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)能夠抑制P．a(chǎn)eruginosa生物膜的形成，用DNaseⅠ處理已建立的P．a(chǎn)eruginosa生物膜60h后，分析其結(jié)果顯示DNaseⅠ可促進(jìn)生物膜分散。用DNaseⅠ預(yù)處理金黃色葡萄球菌生物膜后，再加用妥布霉素后可增強(qiáng)妥布霉素的殺菌活性，這可能與DNaseⅠ能降解eDNA有關(guān)[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，DNase1L2也能促進(jìn)P．a(chǎn)eruginosa及金黃色葡萄球菌的生物膜分散[14]。鏈球菌去氧核糖核酸酶也能干擾已建立的P．a(chǎn)eruginosa生物膜[15]。

1.2.3 糖苷水解酶類(lèi) 糖苷水解酶類(lèi)主要是水解生物膜中的細(xì)胞外多糖成分。細(xì)胞外多糖為生物膜的建立和維持提供了許多重要幫助，比如結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、耐藥性、對(duì)宿主免疫進(jìn)行物理和化學(xué)防御、促微生物細(xì)胞的黏附和聚集及在營(yíng)養(yǎng)不足時(shí)提供碳源。經(jīng)研究，至少有3種細(xì)胞外多糖參與P．a(chǎn)eruginosa感染的生物膜形成，如，Psl、Pel和藻酸鹽，藻酸裂解酶能降解P．a(chǎn)eruginosa菌株生物膜細(xì)胞外多糖-藻酸鹽導(dǎo)致生物膜分散；PslG具有糖苷內(nèi)切酶的典型特征,主要破壞Psl基質(zhì)以分散生物膜中的細(xì)菌[16]。分散蛋白B(DspB)通過(guò)水解β-(1,6)糖苷鍵來(lái)降解多糖，能破壞β-1，6-乙酰氨基葡聚糖(poly-β-1,6-N-acetyl-d-glucosamine,PNAG)，破壞其生物膜基質(zhì)，促進(jìn)生物膜分散解離，使細(xì)菌成浮游狀態(tài)[17]；該酶能作用于多種BF，包括金黃色葡萄球菌，放線菌素，表皮葡萄球菌，鮑曼不動(dòng)桿菌，肺炎克雷伯桿菌，大腸埃希菌，伯克霍爾德菌屬和熒光假單胞菌。研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)菌能產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶，透明質(zhì)酸酶促進(jìn)生物膜的分散主要是通過(guò)分解透明質(zhì)酸；而當(dāng)透明質(zhì)酸酶缺陷時(shí)能抑制生物膜的分散[18]。纖維素酶可由多種微生物產(chǎn)生，其水解的部位是β(1,4)糖苷鍵。FLEMING等[19]研究發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶、纖維素酶能導(dǎo)致金黃色葡萄球菌和P．a(chǎn)eruginosa生物膜的分散。

1.3BF分散與特殊化合物的產(chǎn)生 此外，生物膜分散與一些特殊化合物的產(chǎn)生相關(guān)。生物表面活性劑主要是微生物細(xì)胞表面的兩親化合物，它所具有的表面活性作用能降低細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附作用[20]，此前有報(bào)道將生物表面活性劑作為金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和肺炎克雷伯桿菌的抗菌劑。鼠李糖脂是一種糖脂生物表面活性劑，由連接到脂肪酸鏈上的二-鼠李糖或單-鼠李糖構(gòu)成，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)生物膜分離[7]。PSM-β肽能促進(jìn)表皮葡萄球菌生物膜結(jié)構(gòu)分離[21]。XING等[22]研究發(fā)現(xiàn)，D-氨基酸(D-aminoacids)可以預(yù)防生物膜的形成并分解枯草芽孢桿菌、P．a(chǎn)eruginosa和金黃色葡萄球菌的現(xiàn)有生物膜；D-氨基酸可以由多種細(xì)菌產(chǎn)生，通過(guò)調(diào)整外源性D-酪氨酸水平，生物膜環(huán)境中D-酪氨酸水平越高，黏附性越低，破壞率越高，推測(cè)D-酪氨酸可能是生物膜分散的一種信號(hào)之一。此外，溫度、pH值和營(yíng)養(yǎng)條件(如營(yíng)養(yǎng)饑餓)[23]、一氧化氮(nitricoxide,NO)[24]、金屬敖合劑[25]、脂肪酸樣信號(hào)[26]、乳鐵蛋白[27]等多種因素均可調(diào)節(jié)生物膜的分散。

2 生物膜分散的臨床意義

慢性創(chuàng)面生物膜為微生物群體的生存創(chuàng)造了更好的條件，不利于慢性創(chuàng)面愈合。慢性創(chuàng)面的傳統(tǒng)治療手段一般為采用大劑量的抗生素、物理清創(chuàng)、負(fù)壓吸引及新型敷料等，但其效果均有一定的局限性，且經(jīng)治療后，這些慢性傷口常復(fù)發(fā)。生物膜通過(guò)黏附素黏附于宿主或物體的表面，其細(xì)胞外基質(zhì)有助于生物膜抗生素耐藥性的形成。通過(guò)促進(jìn)生物膜分散階段的發(fā)生，聯(lián)合傳統(tǒng)治療方案可能更利于創(chuàng)面愈合。研究表明QS參與生物膜形成、維持和分散，QS抑制劑(QSinhibition，QSI)可以抑制QS信號(hào)分子合成或降解；抑制信號(hào)分子與受體的結(jié)合或抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的觸發(fā)來(lái)實(shí)現(xiàn)QS抑制。BRACKMAN等[5]提出QSI可作為抗菌劑，如S-腺苷同型半胱氨酸、西奈芬近、5-甲基硫代腺等。金縷梅能干擾金黃色葡萄球菌TraPQS系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁厚度的影響和生物膜eDNA降解釋放，來(lái)達(dá)到生物膜易感性。從分子層面上來(lái)看可能是通過(guò)肽聚糖和肽聚糖前體的生物合成(包括參與L-賴(lài)氨酸和葡糖胺-6-磷酸合成的基因)和自溶調(diào)節(jié)劑(如lytS)的差異性表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的干預(yù)。KUTTY等[28]研究制備不同NO供體的AHL-NO雜交體作用于P.aeruginosa生物膜，并評(píng)估其生物學(xué)作用，結(jié)果表明以硝酸鹽為供體NO的AHL雜交體其生物活性最高，能抑制QS并減少相關(guān)的毒力因子合成，這可能提示將不同的化合物混合可能表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。BHATTACHARJEE等[29]研究發(fā)現(xiàn)由P.aeruginosa產(chǎn)生的鼠李糖脂同樣對(duì)大腸埃希菌生物膜起分散作用，這可能與鼠李糖脂選擇性地改變了大腸埃希菌膜對(duì)某些分子的滲透性(如親脂性AHL中的3oxoC12HSL)有關(guān)。然而單獨(dú)應(yīng)用鼠李糖脂對(duì)大腸桿菌缺乏任何生長(zhǎng)抑制或生物膜分散活性，這提示細(xì)菌衍生的分散劑不但可以分散自身生物膜，還可以對(duì)一些其他細(xì)菌物種生物膜起分散作用。這種能誘導(dǎo)自分散和種間分散的信號(hào)分子為治療以混合菌感染為主的慢性創(chuàng)面提供新的治療方向。體外實(shí)驗(yàn)證明乙二胺四乙酸(EDTA)是P．a(chǎn)eruginosa和金黃色葡萄球菌生物膜的有效分散劑和殺菌劑，加用EDTA可致QS中AI2水平降低，這也為開(kāi)發(fā)抵抗細(xì)菌感染的無(wú)毒的、有效的AHL拮抗劑提供基礎(chǔ)。EDTA和慶大霉素聯(lián)用對(duì)P．a(chǎn)eruginosa生物膜的清除能力優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用EDTA，考慮二者存在協(xié)同作用關(guān)系[30]。經(jīng)生物膜降解酶DNaseⅠ及分散蛋白B預(yù)處理的金黃色葡萄球菌生物膜可增強(qiáng)妥布霉素的殺菌活性[13]。

3 展 望

綜上所述，生物膜的分散階段受到多種機(jī)制調(diào)節(jié)及內(nèi)、外界環(huán)境因素的調(diào)控，研究相關(guān)的促生物膜分散劑能為解決臨床上慢性創(chuàng)面難愈合問(wèn)題提供新思路。然而，臨床中慢性創(chuàng)面以多種細(xì)菌的混合感染為主，且不同的慢性創(chuàng)面病種中，其主要優(yōu)勢(shì)菌群不同，而目前對(duì)于生物膜分散機(jī)制研究均以純種生物膜為基礎(chǔ)，無(wú)法模擬真實(shí)的慢性創(chuàng)面中的微生物生物膜。因此，未來(lái)關(guān)于以混合菌感染的不同的慢性創(chuàng)面BF分散機(jī)制的研究仍有待進(jìn)一步的明確和完善。

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