周佳惠 陳煜

[摘要]目的：考察75%乙醇對(duì)于常見菌種的殺滅效力及使用的時(shí)限，以確保日常消毒的有效性。方法：采用硬面測(cè)試法，考察75%乙醇對(duì)黃色葡萄球菌ATCC6538、銅綠假單胞菌ATCC9027、大腸桿菌ATCC11229的殺滅作用；室溫密封放置15天后，同法測(cè)試消毒效力，以考察使用時(shí)限。結(jié)果：75%乙醇對(duì)黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌的殺滅對(duì)數(shù)值下降了至少3個(gè)對(duì)數(shù)單位，放置15天后效果相當(dāng)。結(jié)論：75%乙醇對(duì)常見菌的消毒效力符合要求，放置15天后消毒效力未受影響。

[關(guān)鍵詞]75%乙醇；消毒效力；使用時(shí)限；驗(yàn)證

醫(yī)院常用的消毒劑75%乙醇、碘酒、新潔爾滅等，主要用于桌面、器械、手套等的消毒，涉及的材料有高密度中纖板、鋼板、無菌手套等。本文根據(jù)《藥品GMP指南（無菌藥品）》13.3章節(jié)的要求[1]，采用實(shí)驗(yàn)室消毒劑效力硬表面測(cè)試法以無菌手套為例驗(yàn)證75%乙醇對(duì)于常見菌種（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌）的殺滅效力，同時(shí)驗(yàn)證該消毒劑的使用時(shí)限，即在放置規(guī)定時(shí)間后對(duì)常見菌種的殺滅效力，確認(rèn)采用75%乙醇能達(dá)到預(yù)期的消毒效果[2-4]。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)基：無菌大豆胰蛋白胨瓊脂（TSA）；稀釋液：滅菌0.9%NaCl溶液；載體：無菌手套；中和劑：硫代硫酸鈉20g/L，配制后滅菌待用。挑戰(zhàn)菌株：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌。滅菌移液槍、生物安全柜、震蕩器、無菌擦拭棉簽、培養(yǎng)箱、無菌擦片、75%乙醇。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備取凍干黃色葡萄球菌菌種管，以無菌操作打開，用毛細(xì)管吸取l.Oml營養(yǎng)肉湯，輕輕吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含5.Oml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置37℃培養(yǎng)18h～ 24h。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于大豆胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上（通過反復(fù)劃線的方式使菌體分布于整個(gè)平板表面），置37℃培養(yǎng)18h～ 24h，得第2代培養(yǎng)物；按上述方法接種培養(yǎng)直至第4代培養(yǎng)物。

取菌種第4代的大豆胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板新鮮培養(yǎng)物（18～24h），精密吸取10.0ml稀釋液加入平板內(nèi)，使用無菌刮棒輕輕刮取瓊脂表面的菌體。再用lO.Oml吸管將稀釋移至另一無菌瓶中，向瓶中加入稀釋液至lOOml，蓋緊瓶蓋后振搖（約80下），得均勻細(xì)菌懸浮。

用細(xì)菌濃度比濁測(cè)定法粗測(cè)其含菌濃度，然后以稀釋液稀釋至所需使用的濃度，得菌懸液。置4℃冰箱內(nèi)備用，當(dāng)天使用不得過夜。

同法配置銅綠假單胞菌、大腸桿菌菌懸液。

1.2.2 載體片制備取無菌手套，在載體上刻畫出數(shù)塊lcmxlcm的區(qū)域（每個(gè)區(qū)域視為一個(gè)載體片），吸取O.01ml107～108Cfu//ml的菌懸液接種到各確定的lcmxlcm區(qū)域上，并用接種環(huán)使菌液在表面充分鋪展開來，自然條件下干燥30～40分鐘，作為染菌載體片備用。

1.2.3 中和劑效力確認(rèn)取兩支試管，分別加入9ml硫代硫酸鈉20g/L，一支加入1ml水作為中和劑毒性試驗(yàn)（Nc組），另一支加入1m175%乙醇作為中和劑中和效力測(cè)試試驗(yàn)（Nr組）；充分混勻，靜置5分鐘。再取一支試管，加入lOml水作為對(duì)照組（No）。

在三支試管中各放入一片接種過的載體片。靜置10分鐘后，將載體片上的微生物全部洗脫到試管中，震勻后進(jìn)行系列稀釋，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。記錄每個(gè)稀釋度l.Oml樣品的菌落數(shù)。選取一個(gè)合適梯度的讀數(shù)，該梯度的兩塊平板的讀數(shù)（記為a1和a2）都應(yīng)處于30至300CFU之間。

按照公式計(jì)算：Nc、Nr或No=109io（a1+a2）/2xlO/d

其中：d=稀釋液的稀釋系數(shù)

Nc=1og10中和劑毒性測(cè)試中每個(gè)菌片上的菌落數(shù)

Nr=1og10中和劑效力測(cè)試中每個(gè)菌片上的菌落數(shù)

No=1og10對(duì)照組測(cè)試中每個(gè)菌片上的菌落數(shù)

接受標(biāo)準(zhǔn)：-0.3各種菌種分別測(cè)試。

1.2.4 消毒效力測(cè)試步驟將75%乙醇均勻噴灑在載體表面作用5分鐘，無菌棉簽沾取中和劑之后進(jìn)行擦拭，并將擦拭后的棉簽折斷投入預(yù)先分配好的Sml中和劑試管中，中和10分鐘后，將棉簽上的微生物通過震蕩的方法（電動(dòng)混合器20s，1500rpm）全部洗脫至試管中，充分震蕩該試管，然后移取Iml到已標(biāo)記過的培養(yǎng)皿中做平板計(jì)數(shù)，每一支試管均做兩塊培養(yǎng)皿，37℃，培養(yǎng)3天，作為消毒測(cè)試組（Nd）。拋棄那些長的太多不能計(jì)數(shù)的平板，將剩余的平板計(jì)數(shù)。

將0.9%NaCl溶液噴灑在載體表面作用5分鐘，無菌棉簽沾取中和劑之后進(jìn)行擦拭，同消毒劑測(cè)試組操作，作為空白對(duì)照（Nc）。

計(jì)算方法同1.2.3項(xiàng)下：Ne（或Nd）= 109io（ai+ a2）/2xlO/d

其中：

d=稀釋液的稀釋系數(shù)

Nc=1og10空白對(duì)照中每個(gè)菌片上的菌落數(shù)

Nd=1og10消毒劑測(cè)試中每個(gè)菌片上的菌落數(shù)

Log下降值=NC-Nd，若下降值超過了5，一律以>5來表示。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：在一定的接觸時(shí)間內(nèi)，消毒劑能夠使挑戰(zhàn)菌水平下降99.9%（下降3個(gè)對(duì)數(shù)單位），則表明該消毒劑能夠作為進(jìn)行日常消毒使用。

1.2.5 75%乙醇消毒存放效期驗(yàn)證75%乙醇常溫密封放置15天后，按照1.2.4法再驗(yàn)證消毒劑效力。

2 結(jié)果

2.1 中和劑效力測(cè)試結(jié)果 中和劑毒性試驗(yàn)、中和效力測(cè)試試驗(yàn)與空白組的差值均在-0.3至0.3之間，符合要求。硫代硫酸鈉20g/L作為中和劑既能有效抑制消毒劑的殺菌性同時(shí)又不削弱微生物活力的恢復(fù)。

2.2 消毒劑效力測(cè)試結(jié)果

75%乙醇能夠使挑戰(zhàn)菌水平下降約5個(gè)對(duì)數(shù)單位，符合要求，能夠作為進(jìn)行日常消毒使用。

2.3 消毒劑存放時(shí)限效力測(cè)試結(jié)果

75%乙醇密封放置15天后，仍能夠使挑戰(zhàn)菌水平下降約5個(gè)對(duì)數(shù)單位，與0天相比基本無變化。

3 討論

75%乙醇對(duì)常見菌的消毒效力符合要求，放置15天后消毒效力未受影響。本試驗(yàn)中所使用的中和劑必須對(duì)于獲得的第2代培養(yǎng)物，將其密封后在4℃保存，時(shí)間不得超過6周。噴灑消毒劑時(shí)應(yīng)保持噴灑次數(shù)、擠壓噴瓶力度和噴灑角度一致以減少實(shí)驗(yàn)誤差。噴灑消毒劑的量以消毒劑剛好可以覆蓋住載體表面為原則，不宜過多和過少。

參考文獻(xiàn)

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