杜嬌，王婭波，李雪華，黃志強(qiáng)，楊宇衡，畢朝位，余洋

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核盤(pán)菌-谷氨酰磷酸還原酶基因的功能分析

杜嬌，王婭波，李雪華，黃志強(qiáng)，楊宇衡，畢朝位，余洋

（西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400715）

【目的】-谷氨酰磷酸還原酶是真菌脯氨酸合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵性酶，本研究旨在對(duì)核盤(pán)菌（）-谷氨酰磷酸還原酶編碼基因進(jìn)行沉默，并對(duì)沉默轉(zhuǎn)化子菌絲生長(zhǎng)、菌核形成和致病力等表型進(jìn)行研究，為揭示核盤(pán)菌的生長(zhǎng)發(fā)育與致病機(jī)理打下基礎(chǔ)，并為作物菌核病的綠色防控提供線(xiàn)索?！痉椒ā客ㄟ^(guò)BLAST進(jìn)行蛋白同源比對(duì)分析，并利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建蛋白進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)在核盤(pán)菌菌絲生長(zhǎng)、菌核發(fā)育和萌發(fā)的各個(gè)階段以及致病不同時(shí)期的表達(dá)模式。根據(jù)RNA干擾原理構(gòu)建的沉默載體，通過(guò)PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將沉默載體轉(zhuǎn)入到野生型核盤(pán)菌菌株1980中。利用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒定基因沉默轉(zhuǎn)化子，對(duì)沉默轉(zhuǎn)化子的菌絲形態(tài)、生長(zhǎng)速度和菌核形成等表型進(jìn)行觀察，并測(cè)定沉默轉(zhuǎn)化子在氧化脅迫條件下的菌絲生長(zhǎng)。將沉默轉(zhuǎn)化子分別接種至活體油菜葉片和擬南芥植株，觀察并測(cè)量病斑大小。通過(guò)酸性茚三酮法對(duì)沉默轉(zhuǎn)化子中的游離脯氨酸進(jìn)行測(cè)定?！窘Y(jié)果】核盤(pán)菌全長(zhǎng)1 454 bp，編碼449個(gè)氨基酸，在氨基酸H10-N426處含有谷氨酰磷酸還原酶結(jié)構(gòu)域。同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)SsGPR1蛋白與灰葡萄孢（）的BC1G_13183蛋白和白霉病菌（）的SBOR_2215蛋白相似性最高，氨基酸序列一致性分別達(dá)95%和94%，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明三者聚為一個(gè)小的分支。在核盤(pán)菌菌絲生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量較高，在菌核不同發(fā)育階段表達(dá)量相近，但均低于菌絲生長(zhǎng)時(shí)期。在致病時(shí)期表達(dá)量不斷升高，在接種后9 h表達(dá)量最高。將基因沉默載體pSIGPR1導(dǎo)入到核盤(pán)菌野生型菌株中，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)不同轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)水平，結(jié)果表明SiGPR1-104和SiGPR1-149為基因沉默轉(zhuǎn)化子。沉默轉(zhuǎn)化子在PDA培養(yǎng)基上形成的菌核數(shù)量及均重與野生型菌株無(wú)顯著性差異，且菌核均能萌發(fā)形成子囊盤(pán)，但菌絲生長(zhǎng)稠密，生長(zhǎng)速度顯著下降。在含有H2O2的培養(yǎng)基中，基因沉默轉(zhuǎn)化子菌絲生長(zhǎng)受到更強(qiáng)的抑制，表明沉默轉(zhuǎn)化子對(duì)氧化脅迫更加敏感?；虺聊D(zhuǎn)化子在活體油菜葉片和擬南芥植株上能引起發(fā)病，但病斑面積減小，表明沉默轉(zhuǎn)化子致病力減弱?；虺聊D(zhuǎn)化子菌絲中的游離脯氨酸含量與野生型菌株相比無(wú)顯著差異?！窘Y(jié)論】與核盤(pán)菌的生長(zhǎng)和菌絲形態(tài)相關(guān)，且參與核盤(pán)菌對(duì)氧化脅迫的抵御及致病過(guò)程。

核盤(pán)菌；脯氨酸；-谷氨酰磷酸還原酶；基因沉默；致病性; 氧化壓力

0 引言

【研究意義】核盤(pán)菌（）是一種世界范圍內(nèi)分布的病原真菌，能侵染400多種植物[1-3]，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。一般認(rèn)為核盤(pán)菌是典型的死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌，其通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶和草酸殺死寄主植物從而獲取營(yíng)養(yǎng)[4-7]。但最近的研究表明，核盤(pán)菌在侵染寄主早期階段存在短暫的活體營(yíng)養(yǎng)階段，其與寄主之間的相互作用比之前認(rèn)為的更為復(fù)雜[7-9]，對(duì)其致病機(jī)理有待于進(jìn)一步深入解析。脯氨酸具有高度水溶性和兩親性，在細(xì)胞代謝、生物抗逆等過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[10]。解析脯氨酸合成相關(guān)基因在核盤(pán)菌生長(zhǎng)發(fā)育及致病過(guò)程中的作用，對(duì)揭示其抵御逆境和致病的分子機(jī)理并進(jìn)一步探索菌核病的綠色高效防控技術(shù)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】當(dāng)生物遭受干旱、低溫和高鹽等逆境時(shí)，細(xì)胞會(huì)發(fā)生滲透脅迫，為適應(yīng)逆境，生物通常會(huì)在短時(shí)間內(nèi)積累一些小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿等，以此增強(qiáng)對(duì)滲透脅迫的抵抗能力，維持膜完整性[11-12]。在哺乳動(dòng)物中，脯氨酸被發(fā)現(xiàn)廣泛參與蛋白質(zhì)的合成、結(jié)構(gòu)和代謝，在傷口愈合、抗氧化反應(yīng)及免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[13]。在植物中，脯氨酸除了作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外，還是一種抗氧化劑、生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)和分子伴侶[14]。Nanjo等[15]研究發(fā)現(xiàn)，抑制擬南芥中脯氨酸脫氫酶的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸水平升高，對(duì)寒冷、高鹽的耐受性增強(qiáng)；Székely等[16]敲除了擬南芥脯氨酸合成的Δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）的兩個(gè)編碼基因和，發(fā)現(xiàn)的敲除突變導(dǎo)致脅迫誘導(dǎo)的脯氨酸合成減少、對(duì)鹽脅迫具超敏感性和活性氧積累，的缺失則導(dǎo)致種子發(fā)育后期的胚胎敗育。在真菌中，Takagi[17]通過(guò)破壞釀酒酵母（）中參與脯氨酸降解的和過(guò)量表達(dá)編碼-谷氨酸激酶的來(lái)增強(qiáng)脯氨酸的合成，發(fā)現(xiàn)酵母菌株表現(xiàn)出對(duì)冷凍、干旱、氧化等耐受性的提高；Chen等[18]發(fā)現(xiàn)刺盤(pán)孢菌（）顯性激活的Ras（dominant activated Ras，DARas）突變體菌株表現(xiàn)出菌絲形態(tài)和發(fā)育異常以及凋亡樣細(xì)胞死亡，而添加脯氨酸的突變體則恢復(fù)了野生型表型，細(xì)胞內(nèi)ROS被清除且細(xì)胞凋亡受到抑制。此外，脯氨酸還與真菌的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，楊佳文等[19]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加脯氨酸可以顯著促進(jìn)大豆炭疽菌（）產(chǎn)生分生孢子。脯氨酸合成是生物體內(nèi)脯氨酸大量累積的重要前提，真菌中脯氨酸的合成與細(xì)菌中脯氨酸的合成途徑大致相同[17]。在細(xì)菌和酵母中，谷氨酸在谷氨酰激酶的作用下，生成谷氨酰磷酸，谷氨酰磷酸很不穩(wěn)定，在-谷氨酰磷酸還原酶（或谷氨酸-5-半醛脫氫酶）的催化下，很快生成谷氨酸半醛，谷氨酸半醛自發(fā)環(huán)化成吡咯琳-5-羧酸，后者最終被吡咯琳-5-羧酸還原酶還原成脯氨酸[20-23]。【本研究切入點(diǎn)】核盤(pán)菌在侵染寄主早期存在短暫的活體階段，在該階段病原菌會(huì)面臨著因寄主植物防御反應(yīng)而造成的逆境，如活性氧爆發(fā)等[24-25]。已有研究表明脯氨酸能影響真菌的形態(tài)建成和發(fā)育，增強(qiáng)其對(duì)氧化等脅迫的耐受性。目前為止，脯氨酸合成相關(guān)基因是否參與核盤(pán)菌的致病過(guò)程還不清楚。本研究前期利用RNA-seq技術(shù)構(gòu)建了核盤(pán)菌侵染時(shí)期的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)基因SS1G_08171在侵染寄主初期表達(dá)量顯著升高，保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)其含有-谷氨酰磷酸還原酶（gamma-glutamyl phosphate reductase，GPR）結(jié)構(gòu)域，同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白與多種真菌中的-谷氨酰磷酸還原酶高度同源，故將其命名為，到目前為止關(guān)于的特性和功能還不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)基因沉默的方式對(duì)進(jìn)行研究，為深入揭示核盤(pán)菌的生長(zhǎng)發(fā)育和致病機(jī)理打下基礎(chǔ)，并為菌核病的綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014—2017年在西南大學(xué)真菌病害研究實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為核盤(pán)菌野生型菌株1980，置于PDA培養(yǎng)基斜面中4℃條件下保存，20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

RNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司TRNzol總RNA提取試劑。反轉(zhuǎn)錄采用Thermo Scientific公司ReventAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，熒光定量PCR采用TOYOBO公司THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix。DNA純化采用天根（同上）通用型DNA純化回收試劑盒。質(zhì)粒提取采用天根（同上）質(zhì)粒小提試劑盒。PCR引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 SsGPR1生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI網(wǎng)站檢索獲得核盤(pán)菌基因序列（SS1G_08171，登錄號(hào)：EDN92308.1）及編碼蛋白序列（登錄號(hào)：XP_001590431.1），蛋白同源性比對(duì)采用BLASTp在線(xiàn)軟件（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi），氨基酸結(jié)構(gòu)域分析采用NCBI Conserved Domain Database在線(xiàn)軟件（https://www.ncbi.nlm. nih.gov），采用MEGA 5.0軟件按照鄰近相似法構(gòu)建蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 SsGPR1表達(dá)分析

將活化好的核盤(pán)菌野生型菌株接種到鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上，倒置于20℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別收集菌絲生長(zhǎng)時(shí)期、菌核形成初期、菌核發(fā)育時(shí)期和菌核成熟時(shí)期的樣品；將經(jīng)過(guò)一段時(shí)間低溫處理的菌核埋入高溫滅菌的河沙中，16℃誘導(dǎo)萌發(fā)并收集菌核萌發(fā)時(shí)期樣品。同時(shí)將野生型菌株置于鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，研缽磨碎收集的新鮮菌絲，利用噴壺噴施擬南芥葉片，分別收集0、3、6、9和12 h的葉片。

利用TRIzol總RNA提取試劑提取樣品總RNA，ReventAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。根據(jù)核盤(pán)菌的mRNA序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光PCR引物RT-Gpr1fp和RT-Gpr1rp（表1），以合成的cDNA為模板，核盤(pán)菌（SS1G_04652）為內(nèi)參[26]，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增，試驗(yàn)重復(fù)3次。擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×SYBR Green real-time PCR Master Mix 10 μL，正/反向引物各0.2 μmol·L-1，cDNA模板50 ng，總體積20 μL。反應(yīng)程序：95℃ 2 min（1個(gè)循環(huán)）；95℃ 20 s，56℃ 15 s，72℃ 20 s（40個(gè)循環(huán)）。

表1 本研究所用引物

1.4 SsGPR1基因沉默載體的構(gòu)建

為構(gòu)建基因沉默載體，以核盤(pán)菌cDNA為模板，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物SiGPR1fp和SiGPR1rp（表1）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×Taq Buffer 5 μL，SiGPR1fp、SiGPR1rp引物各1 μL，Taq酶0.5 μL，cDNA模板1 μL，無(wú)菌水37.5 μL，總體積50 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性 95℃ 3 min；變性95℃ 30 s；退火55℃ 40 s；延伸72℃ 30 s；32個(gè)循環(huán)；終延伸72℃ 10 min。

將上述PCR產(chǎn)物用Ⅰ、d Ⅲ雙酶切，回收后連接到相同酶切的pCIT載體[27]上，雙酶切檢測(cè)連接成功的質(zhì)粒命名為pCIT1；采用同樣方法用Ⅰ、HⅠ雙酶切上述PCR產(chǎn)物，將所得片段連接至相同酶切的pCIT1載體上，將連接成功后的質(zhì)粒命名為pCIT2；將潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因片段連接到pCIT2的Ⅰ酶切位點(diǎn)上，最終的載體命名為pSIGPR1。

1.5 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子的獲取

按照文獻(xiàn)[24]的方法制備原生質(zhì)體，將pSIGPR1質(zhì)粒通過(guò)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化核盤(pán)菌野生型菌株原生質(zhì)體。將挑出的轉(zhuǎn)化子連續(xù)培養(yǎng)3代后，提取各轉(zhuǎn)化子總RNA，用ReventAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈。以合成的cDNA為模板，以為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增，試驗(yàn)重復(fù)3次，擴(kuò)增反應(yīng)體系同前。

1.6 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子形態(tài)特征觀察

將菌株于PDA培養(yǎng)基上活化后打取直徑為6 mm的菌絲塊接種至PDA平板中央，20℃培養(yǎng)24 h后于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲尖端，每個(gè)轉(zhuǎn)化子3次重復(fù)，每隔12 h以十字交叉法測(cè)定菌落直徑并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度。

同樣打取直徑為6 mm的菌絲塊接種至PDA平板中央，每個(gè)轉(zhuǎn)化子重復(fù)3次，將平板倒置于20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d后，收集菌核于室溫下晾干，稱(chēng)取菌核質(zhì)量并記錄菌核數(shù)量。將收集的菌核消毒后半埋于濕潤(rùn)的河沙中，置于16℃條件下誘導(dǎo)萌發(fā)，觀察并記錄菌核的子囊盤(pán)萌發(fā)表型。

1.7 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子在氧化脅迫下的生長(zhǎng)抑制率測(cè)定

以野生型菌株為對(duì)照，在沉默轉(zhuǎn)化子菌落邊緣打取直徑6 mm的菌絲塊，分別接種至MM培養(yǎng)基和含有5 mmol·L-1H2O2的MM培養(yǎng)基平板中央，根據(jù)十字交叉法每12 h測(cè)定菌落直徑，計(jì)算72 h時(shí)菌絲的生長(zhǎng)抑制率。

1.8 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子的致病力測(cè)定

在活化好的野生型及沉默轉(zhuǎn)化子菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌絲塊，菌絲面朝下接種到幼嫩的油菜（中油821）葉片靠近主脈的部位，每個(gè)葉片接種1個(gè)菌絲塊，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，將接種后的植株在20℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，24 h后觀察并拍照記錄葉片發(fā)病情況。同時(shí)將菌絲塊接種于擬南芥（Col-0）葉片上，每株挑取3片不相鄰葉片接種，每個(gè)轉(zhuǎn)化子接種3株，48 h后觀察并拍照記錄葉片發(fā)病情況。

1.9 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子游離脯氨酸含量的測(cè)定

參照朱廣廉等[28]對(duì)植物體內(nèi)游離脯氨酸測(cè)定的方法進(jìn)行脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作，并對(duì)核盤(pán)菌中的游離脯氨酸進(jìn)行提取，具體步驟：分別稱(chēng)取野生型及沉默轉(zhuǎn)化子菌絲各0.5 g（每個(gè)菌株重復(fù)3次以上），置于試管中，向試管中加入5 ml的磺基水楊酸溶液（3%），沸水?。?0 min）后冷卻并過(guò)濾，得到游離脯氨酸的提取液。分別取2 ml的提取液，加入2 ml冰醋酸和2 ml酸性茚三酮溶液（2.5%），沸水浴30 min，冷卻后加入4 ml甲苯，搖蕩30 s，吸取上層溶液于離心管中，離心機(jī)離心5 min（3 000 r/min）。將離心后的溶液置于比色杯中，以甲苯溶液為空白對(duì)照，在520 mm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值并計(jì)算每克菌絲中相應(yīng)游離脯氨酸含量。

2 結(jié)果

2.1 SsGPR1生物信息學(xué)分析

開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1 350 bp，編碼449個(gè)氨基酸。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)SsGPR1在氨基酸H10-N426（E=0）處含有-谷氨酰磷酸還原酶（GPR）結(jié)構(gòu)域。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行蛋白同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)SsGPR1的同源蛋白存在于許多真菌中，如灰葡萄孢（）、白霉病菌（）、白色綠僵菌（）、稻曲病菌（）、禾谷鐮孢（）等（圖1），其中相似性最高的為灰葡萄孢BC1G_13183蛋白（XP001548140.1）和白霉病菌SBOR_2215蛋白（ESZ97387.1），氨基酸序列一致性分別為95%和94%。

2.2 SsGPR1在核盤(pán)菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病時(shí)期的表達(dá)模式

利用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)在核盤(pán)菌野生型菌株不同發(fā)育階段的表達(dá)，結(jié)果如圖2所示，在菌絲生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量較高，在菌核不同發(fā)育階段表達(dá)量相近，但與菌絲生長(zhǎng)時(shí)期相比，表達(dá)量均顯著性降低。將野生型菌株接種至擬南芥植株上，并對(duì)接種后0、3、6、9 和12 h 的表達(dá)量進(jìn)行分析，如圖3所示，該基因在致病過(guò)程表達(dá)水平不斷提高，且在接種9 h后表達(dá)量最高。

黑點(diǎn)表示核盤(pán)菌SsGPR1蛋白位置The black spot indicates the position of S. sclerotiorum SsGPR1 protein

柱上不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同Different lowercases on column mean significantly different (P＜0.05). The same as below

2.3 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子鑒定

利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將pSIGPR1轉(zhuǎn)入到核盤(pán)菌野生型菌株中，并利用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)不同轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)水平，結(jié)果表明，菌株SiGPR1-104和SiGPR1-149中的表達(dá)水平與野生型相比顯著下降（圖4），故將這兩個(gè)菌株作為研究對(duì)象。

圖3 SsGPR1在核盤(pán)菌致病過(guò)程中的表達(dá)

圖4 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子中SsGPR1的表達(dá)

2.4 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子形態(tài)特征

在光學(xué)顯微鏡下分別觀察核盤(pán)菌野生型菌株、SiGPR1-104和SiGPR1-149的菌絲形態(tài)，與野生型菌株相比，基因沉默轉(zhuǎn)化子菌落邊緣菌絲較稠密（圖5）。對(duì)沉默轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)速度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明沉默轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)速度顯著降低（圖6）。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，基因沉默轉(zhuǎn)化子菌核形成數(shù)量（圖7）及干重（圖8）與野生型菌株無(wú)顯著性差異。通過(guò)在室內(nèi)誘導(dǎo)菌核萌發(fā)表明沉默轉(zhuǎn)化子形成的菌核均能萌發(fā)形成子囊盤(pán)，表明與菌核形成及萌發(fā)無(wú)關(guān)。

2.5 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子在氧化脅迫下的生長(zhǎng)

將野生型菌株和SiGPR1-104、SiGPR1-149分別接種于添加了5 mmol·L-1H2O2的MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)定其菌落直徑并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。如圖9所示，與野生型菌株相比，沉默轉(zhuǎn)化子在含有H2O2的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)受到更強(qiáng)的抑制（圖9），表明基因沉默轉(zhuǎn)化子對(duì)氧化脅迫更加敏感。

圖5 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子菌絲形態(tài)

圖6 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)速度

圖7 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子菌核數(shù)量

圖8 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子菌核干重

圖9 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子在氧化脅迫下的生長(zhǎng)抑制率

2.6 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子致病力分析

將野生型菌株、SiGPR1-104和SiGPR1-149分別接種到活體擬南芥植株和活體油菜葉片上，結(jié)果表明與野生型菌株相比，SiGPR1-104和SiGPR1-149在油菜和擬南芥葉片上致病力減弱（圖10），病斑直徑顯著下降（圖11），表明與核盤(pán)菌致病力密切相關(guān)。

圖10 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子致病力測(cè)定

圖11 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子病斑直徑

2.7 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子的游離脯氨酸含量

利用茚三酮法對(duì)野生型菌株、SiGPR1-104和SiGPR1-149菌絲中游離脯氨酸含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示基因沉默轉(zhuǎn)化子與野生型菌株菌絲中的游離脯氨酸含量無(wú)顯著差異（圖12），均在0.175—0.178 μg·g-1，表明與核盤(pán)菌游離脯氨酸的含量無(wú)關(guān)。

圖12 SsGPR1基因沉默轉(zhuǎn)化子游離脯氨酸含量

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)核盤(pán)菌基因編碼一個(gè)-谷氨酰磷酸還原酶同源蛋白，該基因在核盤(pán)菌菌絲生長(zhǎng)時(shí)期及致病初期表達(dá)顯著上調(diào)，基因沉默轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)速度降低，菌絲稠密，致病力下降以及對(duì)氧化脅迫更加敏感，但菌核形成及萌發(fā)表現(xiàn)正常。

由于-谷氨酰磷酸還原酶催化脯氨酸生物合成的第二步[12-15]，為明確在核盤(pán)菌脯氨酸合成中的作用，本研究比較了野生型菌株和基因沉默菌株之間的脯氨酸積累量，結(jié)果卻表明在基因沉默菌株的脯氨酸含量與野生型菌株并無(wú)顯著差異。唐亮[29]研究釀酒酵母谷胱甘肽（GSH）合成途徑時(shí)發(fā)現(xiàn)，除-谷氨酰半胱氨酸合成酶（Gsh1）和谷胱甘肽合成酶（Gsh2）兩個(gè)合成途徑外，還存在一條谷胱甘肽合成的替代途徑，即通過(guò)參與脯氨酸生物合成的第一個(gè)功能蛋白酶-谷氨酰激酶（GK）的功能來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)Gsh1的替代作用，是谷胱甘肽合成的第3條途徑。筆者推測(cè)，當(dāng)基因沉默導(dǎo)致脯氨酸合成受到抑制時(shí)，該替代途徑可能向脯氨酸合成偏移，從而彌補(bǔ)脯氨酸的合成，使脯氨酸的合成相對(duì)穩(wěn)定，而谷胱甘肽的合成是否會(huì)產(chǎn)生影響有待于進(jìn)一步研究。

在致病初期表達(dá)量逐步升高，且基因沉默菌株在油菜和擬南芥上的致病力顯著下降，表明參與調(diào)控了核盤(pán)菌的致病性，但對(duì)于其作用機(jī)理仍不清楚。核盤(pán)菌在侵染初期會(huì)激發(fā)寄主植物的活性氧爆發(fā)，而活性氧能幫助寄主抵御病原菌的侵入[25,30]，Xu等[24]通過(guò)T-DNA插入突變發(fā)現(xiàn)核盤(pán)菌超氧化物歧化酶基因與病原菌抵抗氧化壓力和致病力密切相關(guān)；Yu等[31]將核盤(pán)菌Bax抑制子基因沉默后發(fā)現(xiàn)，基因沉默轉(zhuǎn)化子對(duì)活性氧更加敏感，且致病力顯著下降。這些研究均表明，核盤(pán)菌抵御氧化脅迫的能力與其致病性有著密切聯(lián)系，本研究發(fā)現(xiàn)基因沉默菌株對(duì)于氧化脅迫更加敏感，推測(cè)基因沉默菌株致病力減弱與其抵御活性氧能力下降有關(guān)，而后者可能受到谷胱甘肽含量變化的影響，谷胱甘肽具備抗氧化的特點(diǎn)，作為重要的抗氧化劑和自由基清除劑[32-33]，在核盤(pán)菌侵染過(guò)程中，谷胱甘肽可以幫助抵御植物活性氧迸發(fā)，從而有利于其侵染[34]。

4 結(jié)論

核盤(pán)菌基因編碼一個(gè)-谷氨酰磷酸還原酶同源蛋白，該基因與核盤(pán)菌菌絲形態(tài)和生長(zhǎng)密切相關(guān)，且參與病原菌氧化脅迫和致病過(guò)程。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Function analysis of-glutamyl phosphate reductase-encoded gene

DU Jiao, WANG YaBo, Li Xuehua, Huang Zhiqiang, YANG Yuheng, BI Chaowei, YU Yang

(College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715)

【Objective】The gamma-glutamyl phosphate reductase (GPR) is a key enzyme in fungal proline synthesis pathway. The objective of this study is to silence a GPR-encoded genevia the RNA interference strategy, research the mycelial growth, sclerotial formation and pathogenicity of the gene-silencing transformants, so as to lay a foundation for revealing the growth, development and pathogenicity of. It also provides important clues for the green prevention and control of Sclerotinia disease.【Method】Homology analysis and phylogenetic tree construction were performed through the BLAST search and MEGA 5.0 software. The real-time RT-PCR was used to detect the expression pattern ofat the different stages of mycelial growth, sclerotial development and germination, and infection processes. The gene silencing vector ofwas constructed based on the principle of RNA interference, and the vector was used to transform wild-type strain 1980 by PEG-mediated transformation of protoplasts methods. The gene-silenced strains were identified by real-time RT-PCR. The mycelial morphology, growth rate and sclerotial formation of the gene-silenced strains were observed and the hyphal growth rate under the oxidative stress was measured. The gene-silenced strains were inoculated onleaves andplants, and lesion size was observed and measured. The free proline of gene-silenced strains was assayed using the acid ninhydrin method. 【Result】ofis 1 454 bp in length and encodes 449 amino acids. SsGPR1 protein contains a GPR domain at amino acid H10-N426. SsGPR1 showed high sequence similarity withBC1G_13183 (95% identities) andSBOR_2215 protein (94% identities). The three proteins clustered into a small branch according to the result of phylogenetic tree.showed high expression level during hyphae growth. The expression level was similar during the different development stages of sclerotia, but it significantly decreased compared with that during the hyphal growth period. The expression level ofincreased gradually during the pathogenic period, and it reached the highest at 9 h post inoculation. Thesilencing vector, pSIGPR1 was transformed into the wild-type strain of, and the expression level ofgene-silenced transformants. When cultured on PDA medium,gene-silenced strains had no significant difference with wild-type strain on the number and average dry weight of sclerotia, which can germinate to form apothecium. However, the gene-silenced strains produced denser hyphae and showed a significantly reduce in growth rate. The hyphal growth ofgene-silenced strains was inhibited more strongly when cultured on medium containing H2O2, indicating that the gene-silenced strains were more sensitive to oxidative stress.gene-silenced strains led to small lesions onleaves andplants, indicating that the pathogenicity of the gene-silenced strains was impaired. The content of proline produced bygene-silenced strains had no significant difference with wild-type strain.【Conclusion】is related to hyphal growth and mycelial morphology, and involved in the oxidative stress resistance and pathogenicity of.

; proline; gamma-glutamyl phosphate reductase; gene silencing; pathogenicity; oxidative stress

2018-04-21；

2018-05-28

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0200903）、重慶市基礎(chǔ)與前沿研究一般項(xiàng)目（cstc2017jcyjAX0096）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)“創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”專(zhuān)項(xiàng)（XDJK2017A006，XDJK2018AA004）

杜嬌，E-mail：296532280@qq.com。 通信作者余洋，E-mail：zbyuyang@swu.edu.cn。通信作者畢朝位，E-mail：chwbi2073@sina.com