侯昕彤,周慧
(1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2015級19班,遼寧 沈陽 110034;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室)
20世紀(jì)20年代,組織蛋白酶一詞首次被提出,并被定義為存在于溶酶體中的蛋白水解酶,在低等到高等生物中均有分布[1]?,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有約50種組織蛋白酶,目前對絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶的研究較為深入和廣泛[2]。在溶酶體蛋白酶體系中,半胱氨酸蛋白酶發(fā)揮著相對重要的作用。
半胱氨酸蛋白酶在生物體內(nèi)分布廣泛,目前在人類基因組測序中共發(fā)現(xiàn)了11種相關(guān)酶類[2],在溶酶體這種具有還原性和微酸性的環(huán)境中,能保持最佳活性狀態(tài),其功能是使大量非特異性的內(nèi)源性或外源性蛋白質(zhì)發(fā)生水解、降解[3]。但有研究發(fā)現(xiàn),半胱氨酸蛋白酶可以參與到體內(nèi)某些特異性的生理活動中,當(dāng)該酶系的動態(tài)平衡發(fā)生異常或遭到破壞時,很可能導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生和發(fā)展。人組織蛋白酶主要分為兩大亞族,一種是組織蛋白酶L-like家族,包括組織蛋白酶L、V、K、S、H、W和F,它們共同含有GNFD 和ERFNIN兩個保守基序;另一種是組織蛋白酶B-like家族,只包括含有GNFD基序的組織蛋白酶B[4]。
組 織 蛋 白 酶 V(cathepsin V,CTSV),是Santamaría等于1998年首次發(fā)現(xiàn)的,因其與組織蛋白酶L(CTSL)有78%的同源性,所以又稱為組織蛋白酶L2,是由CTSV基因編碼的蛋白質(zhì),屬于半胱氨酸蛋白酶肽鏈端解酶,在pH值為4時發(fā)揮最佳生理活性[5]。CTSV基因定位于9q22.2染色體,由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成,在人角膜上皮、胸腺和睪丸中高表達(dá)[6],在結(jié)腸癌和乳腺癌中也有表達(dá),而在正常結(jié)腸和乳腺中卻不表達(dá)[7]。這種具有局限性的特殊作用發(fā)揮,可以證實(shí)其參與人體的一些特異性活動中。
人CTSV是由334個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì),分子質(zhì)量37 329 Da,在細(xì)胞內(nèi)以無活性的酶原前體形式存在,由信號肽、前體肽和成熟肽構(gòu)成[5]。前體肽含有α螺旋結(jié)構(gòu),可防止活化中心被激活和分化,成熟肽N端殘基與α螺旋方向相反,后者可跨越活性中心與底物結(jié)合,通過自我催化或被其他酶活化發(fā)生作用[8]。CTSV由兩個大小相似的R-結(jié)構(gòu)域和L-結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,組織蛋白酶的活性位點(diǎn)位于兩結(jié)構(gòu)域交界面的V形活性區(qū)域,分別是 Cys138、His277和 Asn301[5]。CTSV 的結(jié)構(gòu)見圖1[9]。人CTSV包含3個潛在的N-糖基化位點(diǎn),位于2、221和292,但被證實(shí)能夠發(fā)生N-糖基化的只有Asn221和Asn292,它們對于CTSV運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中起重要作用[9]。Asn221和 Asn292兩個 N-糖基化位點(diǎn)的位置并不接近活性位點(diǎn)。因此,在Asn292N-糖基化可能有助于其底物的直接識別,對Asn292位點(diǎn)N-糖基化的抑制可能會間接影響其酶的活性[9]。
圖1 CTSV的結(jié)構(gòu)[9]
CTSV由前體肽、信號肽、成熟肽三部分組成,通過前體酶原水解而成為有活性的酶。前體的正確剪切,對于新合成的半胱氨酸蛋白酶多肽鏈的正確折疊和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定有重要意義。如果剪切地點(diǎn)發(fā)生異常,半胱氨酸蛋白酶在發(fā)揮作用前與蛋白酶抑制劑結(jié)合從而失去活性。另外,不當(dāng)?shù)膒H條件也會導(dǎo)致組織蛋白酶失活。
在高等哺乳動物體內(nèi),CTSV的一般合成途徑為:首先,前體酶原在核糖體結(jié)合膜上合成,信號肽將在核糖體上表達(dá)的前體酶原轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng),在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,信號肽和前體肽間的肽鍵發(fā)生斷裂,信號肽從前體酶原上去除,形成只含前體肽和成熟肽的酶原,因?yàn)榍绑w肽占據(jù)酶原活性中心,酶原無法和相應(yīng)受體結(jié)合,因此不具有催化活性;隨后,酶原被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)溶酶體,在溶酶體的酸性條件下發(fā)生自動水解,將前體肽去除,產(chǎn)生具有酶活性的成熟的CTSV;在此步驟中,發(fā)現(xiàn)前體肽也可以作為能夠阻止酶原活性的高親和性可逆抑制劑[10]。
研究表明,CTSV是E2F1的促凋亡靶點(diǎn),E2F1可以直接結(jié)合到CTSV的啟動子上,被外源性和內(nèi)源性E2F1所調(diào)控;RNAi介導(dǎo)的CTSV沉默可以有效消除異位E2F1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,與溶酶體膜通透性(LMP)的減少和線粒體膜的去極化相關(guān);CTSV敲低也能抑制DNA損傷所激活的內(nèi)源性E2F1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[11]。
4.1 生理作用 在生物體內(nèi),CTSV作用廣泛,可以參與如抗原提呈、蛋白水解、T細(xì)胞分選、胚胎發(fā)育以及細(xì)胞凋亡等一系列生理活動過程。
人CTSV參與神經(jīng)遞質(zhì)腦啡肽和神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)的產(chǎn)生,人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中,通過siRNA干擾CTSV,可使人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞產(chǎn)生的腦啡肽減少80%以上[12]。CTSV在角膜上皮中高表達(dá),其可以水解纖溶酶原,纖溶酶原也在人角膜中高水平表達(dá),可產(chǎn)生血管抑制素相關(guān)分子,CTSV對纖溶酶原的加工,導(dǎo)致其釋放血管抑制素分子,從而抑制血管生成,在維持角膜無血管性中發(fā)揮重要作用[13]。缺乏CTSL的小鼠顯示出復(fù)雜的皮膚表型,包括周期性脫發(fā)、表皮增生、棘皮癥和角化過度等,CTSV轉(zhuǎn)基因小鼠與CTSL敲除小鼠雜交,子代小鼠顯示表皮增殖,表皮厚度和頭發(fā)表型的正?;砻鰿TSV水解活性在維持表皮和毛囊中的角質(zhì)形成細(xì)胞特異性功能中發(fā)揮重要作用,并且CTSV可在人皮膚中發(fā)揮類似功能[14]。
在人類免疫功能中,CTSV同樣發(fā)揮重要作用。半胱氨酸蛋白酶影響CD4+T細(xì)胞的陽性選擇,在CTSL缺失的小鼠體內(nèi),胸腺上皮細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞的陽性選擇削弱;在這些胸腺上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了恒定鏈水解中間產(chǎn)物的積累;但在周邊抗原提呈細(xì)胞中,恒定鏈加工并未受到影響,這說明CTSL特異性地在小鼠胸腺中發(fā)揮功能;在人體內(nèi),發(fā)揮此功能的是CTSV[15]。
4.2 病理作用 CTSV是人胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞中的優(yōu)勢半胱氨酸蛋白酶,與健康對照組相比,神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的自身免疫性疾病重癥肌無力患者的胸腺中CTSV表達(dá)水平顯著更高,提示CTSV可能參與重癥肌無力的免疫發(fā)病機(jī)制[16]。
有研究表明,CTSV與人乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。當(dāng)藥物作用于乳腺癌細(xì)胞使其溶酶體膜受到破壞時,CTSV作為溶酶體蛋白酶,大量彌散于細(xì)胞質(zhì)中引發(fā)自噬[17]。
動脈粥樣硬化是一種慢性炎性病變,以動脈管壁的增厚、彈性喪失和血管壁的細(xì)胞外基質(zhì)大量重塑為主要病理特點(diǎn),其中膠原蛋白和彈性蛋白起重要作用[18-19]。CTSV在人類單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞表達(dá),是迄今為止人類最具彈性蛋白解離活性的組織蛋白酶,CTSV的增加會加速病變動脈的彈性蛋白基質(zhì)的破壞,從而加速動脈粥樣硬化病變的形成[19]。炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和單核細(xì)胞的結(jié)合會刺激CTSV的表達(dá)并活化內(nèi)皮細(xì)胞,在心血管疾病中負(fù)責(zé)發(fā)起局部蛋白的水解[20]。
1型糖尿病是自身免疫病,在1型糖尿病患者的血液中可查出多種自身抗體,這些異常的自身抗體可以損傷人體胰島β細(xì)胞[21],使之不能正常分泌胰島素。Viken等[21]研究發(fā)現(xiàn),位于CTSV基因下游的rs16919034多態(tài)性與1型糖尿病相關(guān),并且還發(fā)現(xiàn)位于CTSV基因上游的另一rs4361859多態(tài)性與早發(fā)性重癥肌無力相關(guān)。
綜上所述,CTSV參與多種機(jī)體生理和病理過程,CTSV抑制劑具有較好的應(yīng)用前景,針對其作用特點(diǎn),尋找其相應(yīng)的選擇性、可逆性抑制劑用于臨床疾病的治療,值得進(jìn)一步研究和探索。
通過對CTSV的深入了解和研究,可以為今后開發(fā)抗腫瘤藥物,如乳腺癌和大腸癌等,治療人重癥肌無力、1型糖尿病等免疫疾病及治療動脈粥樣硬化等疾病提供新思路,有著重要的學(xué)術(shù)價值和社會效益。