程煒，湯俊梅

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液相色譜法檢測生物樣本中苯肽胺酸的含量＊

程煒，湯俊梅

（蘇州健雄職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 蘇州 215411）

采用液相色譜法檢測生物樣本中苯肽胺酸的含量，進一步探究苯肽胺酸藥物的使用價值。選取適宜研究的大鼠血樣和組織樣本，采用液相色譜法對含有苯肽胺酸的空白樣本進行檢測，且使色譜條件優(yōu)化，將含有苯肽胺酸藥物的雜峰和色譜峰有效分離。運用不同流動相對大鼠血樣和組織樣本進行洗脫，研究觀察液相色譜法的驗證結(jié)果，并對樣本的穩(wěn)定性和絕對回收率情況進行研究。結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度下樣本的日間精密度和日內(nèi)精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.17%～1.72%，重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)差為3.58%～3.82%；室溫和凍存環(huán)境下不同濃度質(zhì)量濃度樣本的相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.52%～3.72%，藥物回收率為92.3%～98.5%；大鼠血樣的絕對回收率為92.9%～96.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.14%～5.01%，組織樣本的絕對回收率為85.5%～97.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.15%～5.02%.因此，采用液相色譜法檢測生物樣本中苯肽胺酸的含量具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，且符合實驗要求，可用于相關(guān)實驗，值得進一步推廣和應(yīng)用。通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，藥物的色譜峰的峰型會受到pH值的影響。

液相色譜法；生物樣本；苯肽胺酸；SD大鼠

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物的資料

選取多只健康成年的雄性SD大鼠在普通條件下飼養(yǎng)，大鼠的體質(zhì)量為232～315 g，平均體質(zhì)量為（269.2±2.4）g。

1.1.2 研究物的資料

苯肽胺酸，粉末狀，淡黃色，與有機溶劑相溶，微溶于水，在光環(huán)境下穩(wěn)定性差，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96%以上。

1.1.3 使用試劑的資料

氯化鈉（國藥準(zhǔn)字H20123141，100 mL：0.9 g，化學(xué)藥品，宜昌三峽制藥有限公司）、乙腈（國藥準(zhǔn)字H10973068，化學(xué)藥品，廣東希埃醫(yī)藥有限公司）和甲酸。

1.1.4 儀器設(shè)備的資料

液相色譜儀（2695電化學(xué)檢測器，產(chǎn)自美國惠普公司）、PDA檢測器（產(chǎn)于美國的Waters公司）、XB-NH2色譜柱（來源于中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，規(guī)格為4.6 mm×250 mm）、T18均漿機（產(chǎn)于德國的伊卡集團）和KDC-160HR高速冷凍離心機（來源于可達(dá)創(chuàng)新股份有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠血樣的處理

取大鼠100 μg的空白血清加入200 μg苯肽胺酸溶液中均勻搖晃，并根據(jù)實驗要求在無光環(huán)境下保存。加入600 μg含甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的乙腈溶液中，在4 ℃的環(huán)境下進行離心分離，分離速度為15 000 r/min，分離結(jié)束后取0.22 μm的上清液，然后在過濾器上過濾，留置過濾液待測。

1.2.2 組織樣本的處理

取組織樣本0.3 g，然后加入0.5 mL的苯肽胺酸溶液中混勻，在適當(dāng)條件下保存；加入1.2 mL含甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的乙腈溶液中混勻，放置30 min后加入0.6 mL的氯化鈉溶液中后進行混勻，放置20 min后溶液分層，將上層溶液放置于離心管內(nèi)，在室溫環(huán)境下進行離心分離，分離速度為3 000 r/min；結(jié)束后取上清液，再進行15 000 r/min的離心分離8 min，取0.22 μm的上清液，然后在過濾器上進行過濾，留置過濾液待測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS18.0對數(shù)據(jù)進行分析，其中，計數(shù)進行2（%）檢驗，計量進行檢測（±）檢驗，＜0.05提示有明顯差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 日間和日內(nèi)精密度、重復(fù)性的驗證結(jié)果

在100 mg/L、10 mg/L、1 mg/L的樣本質(zhì)量濃度下，樣本的日間精密度和日內(nèi)精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.17%～1.72%，重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)差為3.58%～3.82%，具體如表1所示。

表1 液相色譜法對日間和日內(nèi)精密度、重復(fù)性的驗證結(jié)果

樣本質(zhì)量濃度/（mg/L）實際質(zhì)量濃度/（mg/L）標(biāo)準(zhǔn)差相對標(biāo)準(zhǔn)偏差/（%） 日內(nèi)精密度100100.250.1620.17 109.870.1671.72 10.980.0010.19 日間精密度100100.250.1620.17 109.870.1671.72 11.000.0050.65 重復(fù)性10099.353.5413.62 109.870.3813.85 11.020.0363.58

2.2 樣本穩(wěn)定性的研究

在100 mg/L、25 mg/L、2 mg/L的樣本質(zhì)量濃度下，經(jīng)研究得，室溫和凍存環(huán)境下的相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.52%～3.72%，藥物回收率為92.3%～98.5%，具體如表2所示。

表2 室溫和冷存環(huán)境下樣本穩(wěn)定性的分析研究

組別樣本質(zhì)量濃度/（mg/L）回收率/（%） 標(biāo)準(zhǔn)差相對標(biāo)準(zhǔn)偏差/（%） 12平均值 凍存10096.7 99.598.50.0131.35 2597.2 97.597.40.0050.52 298.2 92.396.30.0363.72 室溫10099.5 98.298.50.0111.65 2597.2 99.397.90.0131.23 290.5 93.292.30.0232.41

2.3 樣本回收率的處理結(jié)果

加入藥物后測定的樣本色譜峰的面積為0，通過稀釋后得到色譜峰的面積為1，絕對回收率=01×100%.組織樣本的樣本主要有脾臟、心臟、肝臟、大腦以及脂肪樣本等組織，通過對組織樣本和大鼠血樣回收率的研究得出，大鼠血樣的絕對回收率為92.9%～96.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.14%～5.01%，組織樣本的絕對回收率為85.5%～97.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.15%～5.02%.

3 結(jié)論

在本次實驗研究中，樣本日內(nèi)和日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，且重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，樣本的回收處理率均大于90%，樣本穩(wěn)定性均小于5%，所以，建立液相色譜法具備簡易、重現(xiàn)性高、方便等優(yōu)點，其檢測方法可作為藥物檢測的方法。此外，采用液相色譜法分離生物樣本中的苯肽胺酸是由苯肽胺酸自身的熔點和分解溫度決定的，利用此方法可充分測定其含量。

在本次研究中，選用XB-NH2色譜柱作為分析生物樣本中苯肽胺酸含量的分析柱，有利于藥物中的色譜峰和血樣樣本中的雜峰有效分離。通過實驗發(fā)現(xiàn)，流動相的pH值與有機相的比例情況會對藥物的分離效果產(chǎn)生一定的影響。綜上所述，采用液相色譜法檢測生物樣本中苯肽胺酸的含量具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，且符合實驗要求，可用于相關(guān)實驗的實驗參考方法，值得進一步推廣和應(yīng)用。通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，藥物的色譜峰的峰型會受到pH值得影響。

［1］韋思華，代玲玲，周峰，等.高效液相色譜法檢測生物樣本中苯肽胺酸的含量［J］.農(nóng)藥，2016，25（01）：33-35.

［2］韋思華，代玲玲，周峰，等.苯肽胺酸在大鼠體內(nèi)的毒物動力學(xué)及組織分布［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2016，18（01）：71-76.

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2095－6835（2018）18－0130－02

S482.8

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2018.18.130

2017 年蘇州健雄職業(yè)技術(shù)學(xué)院“三級聯(lián)動”科研基金項目與專項課題“液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定犬尿氨酸的方法開 發(fā)與驗證”（課題編號：2017SJLD19）階段成果

〔編輯：張思楠〕