蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化探索

王彥玲 黃琳燕

摘 要：蛋白質(zhì)的醋酸纖維薄膜電泳分離速度快，對(duì)樣品吸附少，分離條帶清晰，靈敏度高，樣品用量少，是本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，然而在實(shí)踐過程中發(fā)現(xiàn)諸多問題，本文從電泳液、漂洗液及實(shí)驗(yàn)各環(huán)節(jié)細(xì)節(jié)方面進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，取得了良好的實(shí)驗(yàn)效果。

關(guān)鍵詞：醋酸纖維薄膜;硼酸緩沖液;蛋白質(zhì)電泳;實(shí)驗(yàn)教學(xué)

中圖分類號(hào)：Q5-33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2019）22-0201-02

蛋白質(zhì)的醋酸纖維薄膜電泳是以醋酸纖維薄膜為介質(zhì)進(jìn)行的蛋白質(zhì)電泳分離實(shí)驗(yàn)，由于其分離速度快，對(duì)樣品吸附少，染色后背景能完全脫色，靈敏度高，樣品用量少，操作簡單等特點(diǎn)，是臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)手段[1]，也是本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開展的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目[2]。在過去的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，通常以PH8.4的巴比妥緩沖液為電泳液，以人血清為樣本進(jìn)行電泳分離，電泳后以氨基黑染液進(jìn)行染色固定，漂洗至背景無色后吸干水分觀察結(jié)果。人血清電泳后在薄膜上可形成5條清晰的區(qū)帶，從正極到負(fù)極依次為白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白[3]。然而，在多年的實(shí)踐過程中發(fā)現(xiàn)，巴比妥緩沖液在配制時(shí)較難溶解，常需加熱1-2小時(shí)方可溶解完全，且在電泳過程中容易有溶質(zhì)析出，電泳效果不理想。同時(shí)配制緩沖液所需的巴比妥和巴比妥鈉均為麻醉鎮(zhèn)靜藥物，近年來國家對(duì)毒麻藥品的管制日趨嚴(yán)格，在試劑采購和學(xué)生實(shí)驗(yàn)的安全性方面有諸多限制[4]。另外，在染色液和漂洗液的配方中含有大量甲醇，甲醇有毒且易揮發(fā)，存在較大安全隱患。在實(shí)驗(yàn)過程中，由于學(xué)生對(duì)細(xì)節(jié)把握不好，常出現(xiàn)學(xué)生正反面錯(cuò)點(diǎn)、錯(cuò)放，點(diǎn)樣時(shí)條帶過干或過濕，點(diǎn)樣區(qū)接觸濾紙橋，樣品太多、太少等問題，導(dǎo)致電泳效果不理想。針對(duì)以上問題，本文從電泳液、漂洗液及實(shí)驗(yàn)各環(huán)節(jié)細(xì)節(jié)方面進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，取得了良好的實(shí)驗(yàn)效果。

1 儀器、試劑及材料

1.1 儀器

DYY-8C型電泳儀（北京六一儀器廠），DYCP-38A型臥式水平電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.2 試劑

0.06mol/L PH 8.4的巴比妥緩沖液：稱取巴比妥鈉10.3g、巴比妥1.84g，加蒸餾水溶解，定容至1000ml。

0.2mol/L PH 8.4的硼酸鹽緩沖液：稱取硼砂8.58g，硼酸6.8g，加蒸餾水溶解定容至1000ml。

染色液：氨基黑10B 0.5g，溶于冰醋酸10ml、無水乙醇50ml、水40ml的混合液中，于試劑瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

漂洗液：無水乙醇45ml，蒸餾水50ml，冰醋酸5ml，混勻后于試劑瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 材料

健康人血清，2cmx8cm醋酸纖維薄膜（路橋四甲生化塑料廠），自制點(diǎn)樣器，鑷子等。

2 實(shí)驗(yàn)過程

制作濾紙橋，注入電泳液→浸泡薄膜→點(diǎn)樣→電泳→染色→漂洗→觀察結(jié)果，拍照。

3 實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化改進(jìn)

3.1 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備

電泳槽兩側(cè)液面要保持在同一水平線;濾紙橋制作時(shí)要卡緊，防止突出太多沾到條帶上的樣品，影響實(shí)驗(yàn)效果。濾紙橋要濕透，而中間的平臺(tái)上要保持干燥，不要存有液體，防止電泳時(shí)薄膜中間沾到電泳液，使薄膜濕度不均，影響實(shí)驗(yàn)效果。薄膜拿到后先分辨出無光澤面，在無光澤面右上角用鉛筆標(biāo)記學(xué)號(hào)后兩位，在后續(xù)點(diǎn)樣和觀察結(jié)果時(shí)始終保持標(biāo)記在右上角，便于分辨正反面和點(diǎn)樣端。注意不要用記號(hào)筆做標(biāo)記，否則在后續(xù)染色和漂洗過程中標(biāo)記會(huì)脫色消失。

3.2 點(diǎn)樣

點(diǎn)樣前將薄膜從緩沖液中撈出，用吸水紙吸去多余的水分，注意不要過分吸干，要保持薄膜濕潤狀態(tài)（無白點(diǎn)，白斑）;也不要過濕，否則樣品容易彌散，條帶不成型。實(shí)驗(yàn)人數(shù)較多時(shí)，不要將薄膜一次全部撈出，應(yīng)按次序輪流操作，輪到自己時(shí)，再將自己的薄膜撈出。點(diǎn)樣時(shí)在平整光滑的平面上點(diǎn)樣，無光澤面朝上，即保持所做標(biāo)記在右上角，樣品不要沾太多或太少，沾取樣品后，在培養(yǎng)品邊緣靠去呈液滴狀多余的血清再點(diǎn)樣，使得點(diǎn)樣后呈均一的一條直線;點(diǎn)樣線應(yīng)平行于薄膜的短邊，并與薄膜的短邊邊緣留有約1.5cm的距離，防止放置薄膜時(shí)樣品碰到濾紙橋;點(diǎn)樣前可先用鉛筆在薄膜準(zhǔn)備點(diǎn)樣位置劃一條直線，引導(dǎo)點(diǎn)樣;學(xué)生可先在濾紙上練習(xí)點(diǎn)樣，熟悉點(diǎn)樣器操作和樣品量的控制。

3.3 電泳

點(diǎn)樣完成后，及時(shí)的將薄膜放置在濾紙橋上，注意點(diǎn)樣面朝下，點(diǎn)樣端在負(fù)極，另一端在正極。放置時(shí)，應(yīng)使薄膜邊緣先與濕潤的濾紙接觸，然后緩緩放置，防止薄膜與濾紙產(chǎn)生氣泡。還應(yīng)提醒學(xué)生，注意放置時(shí)防止樣品沾到濾紙橋。實(shí)驗(yàn)課時(shí)學(xué)生人數(shù)較多，點(diǎn)樣花費(fèi)時(shí)間長，應(yīng)要求每個(gè)學(xué)生放置薄膜后及時(shí)將電泳儀蓋上蓋子，防止先點(diǎn)樣的條帶在空氣中中間部分干燥，薄膜濕潤度不均，影響實(shí)驗(yàn)效果。全部點(diǎn)樣完成后，蓋上蓋子，使薄膜平衡5-10分鐘后再開始電泳。電泳時(shí)，巴比妥緩沖液采用160v，40min電泳，硼酸鹽緩沖液采用160v，20min電泳。

3.4 染色、漂洗

電泳完成后，將薄膜轉(zhuǎn)移至盛有染色液的培養(yǎng)皿中，注意，薄膜要一條一條的放入，保證兩條薄膜間沒有無染液的重疊區(qū)。染色30s即可進(jìn)行漂洗。漂洗至背景無色后，擦干表面水分，保持標(biāo)記在右上角，觀察并拍照。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，以巴比妥緩沖液為電泳液得到的薄膜僅可看見2-3條清晰條帶（圖1a），改為硼酸鹽緩沖液電泳后，可得到清晰的5條條帶（圖1b，f，g）。條件優(yōu)化前，經(jīng)常發(fā)生點(diǎn)樣過多，有液滴，條帶形狀不好，不容易辨認(rèn)（圖1c）;樣品點(diǎn)在光面，薄膜正負(fù)極放錯(cuò)，導(dǎo)致無條帶（圖1d）;點(diǎn)樣時(shí)薄膜沒有擦干多余水分，放置薄膜時(shí)樣品碰到濾紙橋或者沾到濾紙橋平面上灑落的電泳液導(dǎo)致樣品彌散，條帶模糊（圖1e），條件優(yōu)化后，得到清晰的條帶（圖1b，f，g）。

5 討論

傳統(tǒng)的醋酸纖維薄膜電泳通常以0.06mol/L的巴比妥緩沖液進(jìn)行電泳，染色液以甲醇、醋酸和水的混合物為溶劑，漂洗液中也含有大量甲醇。然而巴比妥類屬于管制藥品，學(xué)生實(shí)驗(yàn)也存在一定的安全隱患，而甲醇有毒，且易揮發(fā)，學(xué)生實(shí)驗(yàn)課人數(shù)多，接觸時(shí)間長，易損害學(xué)生健康。本文探索了以硼酸鹽緩沖液進(jìn)行電泳，以乙醇替代染色液和漂洗液中的甲醇的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，?shí)驗(yàn)結(jié)果證明，和傳統(tǒng)的巴比妥緩沖液相比，以硼酸鹽緩沖液進(jìn)行電泳條帶分離更清晰，更易辨認(rèn)，血清蛋白的5條皆可分離，且實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間更短，僅需電泳20min即可得到良好的分離效果;改良后的染色液和漂洗液使用后，條帶染色清晰，背景脫色完全。通過實(shí)驗(yàn)各環(huán)節(jié)的優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)效果得到了很大改善，可以穩(wěn)定的分離出清晰的條帶，實(shí)驗(yàn)的安全性也得到了提高，可供廣大開展醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)教學(xué)的機(jī)構(gòu)借鑒。

參考文獻(xiàn)

[1] 張龍翔，等編.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，1997.

[2] 王慶松，文朝陽，李寶紅，等.醫(yī)學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)第二課堂教學(xué)的探索與實(shí)踐[J].繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2014，28（11）：91-93.

[3] 童紅梅，靳彩虹，李多福，等.醋酸纖維薄膜電泳法分離人外周血清蛋白實(shí)驗(yàn)技巧探討[J].衛(wèi)生職業(yè)教育，2012，30（8）：105-106.

[4] 王慶松，馬惠蘋，劉華.硼酸緩沖液用于醋酸纖維薄膜電泳的分離效果以及在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用[J].繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2017，31（8）：65-66.