國微，楊新朝，閆堯，姜銳

（北華大學(xué)理學(xué)院，吉林吉林 132013；吉林省中藥生物技術(shù)創(chuàng)新中心，吉林吉林 132013）

堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，以下簡稱bFGF）是細胞生長和分化的重要調(diào)節(jié)因子，具有促血管生成、細胞增殖、細胞趨化、細胞遷移等活性，能促進愈合傷口產(chǎn)生膠原蛋白、纖維連接蛋白和基質(zhì)酶的基質(zhì)成分、抑制瘢痕形成,作為皮膚組織中的受體結(jié)合分子，bFGF啟動皮膚細胞的生長、分裂和分化、恢復(fù)細胞的活性的作用，使bFGF的應(yīng)用開始從臨床進入護膚美容領(lǐng)域，并顯示其對美容駐顏的巨大潛力，而被稱為“二十一世紀(jì)的化妝品”，在皮膚美容方面具有十分廣闊的開發(fā)利用前景。巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是目前研究和應(yīng)用較多的外源蛋白表達系統(tǒng)[1]，到目前為止已有400多個外源蛋白得到成功表達，是目前分子生物學(xué)領(lǐng)域中用于表達重組蛋白的標(biāo)準(zhǔn)工具之一，也是具有前景的商業(yè)蛋白生產(chǎn)工具之一[2-3]。由于畢赤酵母表達系統(tǒng)的卓越性和bFGF的強大的生物功能，本實驗室構(gòu)建了畢赤酵母bFGF轉(zhuǎn)化株，但菌種插入的bFGF基因是否能夠得以表達，且表達量是否存在差異，本研究對轉(zhuǎn)化株進行bFGF基因表達篩選及鑒定，并篩選出表達量較高的菌株作為菌種為后續(xù)大規(guī)模發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

吉林省中藥生物技術(shù)創(chuàng)新中心實驗室構(gòu)建的畢赤酵母菌bFGF轉(zhuǎn)化株His+型，-80 ℃冰箱凍存菌種。

1.2 主要試劑及藥品

RD液體培養(yǎng)基、RDB瓊脂平板、RD頂層瓊脂、MD平板、MM平板、YPD培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基、試劑盒：Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit For Fibroblast Growth Factor2，Basic(FGF2)，Cloud-Cline Corp。

1.3 儀器

搖床（興科THZ82A）、天平(HANGPING JY2002型)、立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安LDZX型）、恒溫培養(yǎng)箱（博訊DNP-9002BS型）。

1.4 實驗方法

1.4.1 畢赤酵母重組菌的Mut+Muts表型篩選[11]

取2010年凍存于-80 ℃冰箱的畢赤酵母菌bFGF轉(zhuǎn)化株甘油凍存菌，編號9D和X各1管，解凍取100 μL，加入到10 mL融化的RD液體培養(yǎng)基中，輕搖震蕩混勻，傾倒于RDB瓊脂平板上，靜置凝固后將平板倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，頂層瓊脂中有大量轉(zhuǎn)化株出現(xiàn)。于超凈臺內(nèi)用無菌涂布器刮取頂層瓊脂，放入到50 mL無菌離心管中，加入20 mL無菌去離子水制成懸浮液，通過漩渦震蕩使菌從瓊脂中分離出來。用4層無菌紗布過濾去除瓊脂，剩余濾液用8000rpm離心5分鐘，菌體沉淀在離心管底部，小心剝離上層的瓊脂，輕輕將上清倒掉，加入5 mL無菌去離子水重懸菌體。蘸取重懸液在MD平板上劃線，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2 d后用牙簽挑取單克隆，同時在MD和MM平板的同一位置接種，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。

1.3.2 bFGF轉(zhuǎn)化株測序及比對

36 h后，選取即在MM又在MD培養(yǎng)基上生長的單克隆接種入10mlYPD培養(yǎng)基中，分別編號9d1～9d6、x1～x5，置于搖床200 r/min，28 ℃，約24 h菌液OD600＞2時停止培養(yǎng)，取5 mL培養(yǎng)液離心棄上清，沉淀送上海生工生物工程有限公司測序。

測序結(jié)果通過Blast進行序列比對，確定目的基因是否為bFGF。

1.3.3 轉(zhuǎn)化株bFGF表達量篩選

取確定為bFGF轉(zhuǎn)化株的YPD培養(yǎng)液200 μL加入到20 mL BMGY培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，其余加入15%甘油后分裝凍存。BMGY培養(yǎng)約24 h后停止，8000rpm離心5分鐘，棄上清，加入BMMY培養(yǎng)基重懸菌體至OD600=1.0，取20 mL為一瓶，置于搖床28 ℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)，添加甲醇保持甲醇終濃度0.5%。4 d后，8000rpm離心10 min，取上清液凍干、稱重。試劑盒測定各菌株bFGF表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mut+Muts 表型篩選結(jié)果

Mut+為甲醇利用型，既在MD培養(yǎng)基上生長，又在MM培養(yǎng)基上生長，Muts為甲醇緩慢生長型，只在MD培養(yǎng)基上生長。實驗結(jié)果（圖1）顯示從編號9D、X的畢赤酵母重組菌中挑取的共99個單克隆均為Mut+型。

圖1 單克隆表型篩選結(jié)果

2.2 測序及比對

菌樣送上海生工生物工程有限公司檢測。使用通用引物對菌體基因組進行擴增，結(jié)果如表1所示。9d1、9d2、9d3、9d6、x2、x3、x4、x5均含有插入片段，對插入片段PCR產(chǎn)物進一步測序，測序結(jié)果通過BLAST進行序列比對，顯示插入的目的片段與人FGF2基因序列系列相似度為100%，即以上菌株確定為bFGF轉(zhuǎn)化株。且11個單克隆中有8個檢出目的基因，確定畢赤酵母菌bFGF轉(zhuǎn)化株可表達bFGF基因。

2.3 轉(zhuǎn)化株表達bFGF能力篩選

使用試劑盒對不同轉(zhuǎn)化株單克隆發(fā)酵液的bFGF表達量進行測定，結(jié)果如表2所示。其中，9d3表達量最高，凍干粉中bFGF含量為0.27 ng/g，發(fā)酵液表達量為13.14 ng/L。因此，適宜選取9d3作為后續(xù)大規(guī)模發(fā)酵的菌種。

表1 PCR及序列比對結(jié)果

圖2 9d3的PCR產(chǎn)物序列與bFGF基因序列比對情況

表2 不同單克隆bFGF表達量情況

圖3 不同單克隆bFGF表達量情況

3 討論

重組質(zhì)粒在酵母菌中的穩(wěn)定存在是決定外源基因高效穩(wěn)定表達的前提[1]。盡管重組畢赤酵母菌表達菌株較其他工程菌而言遺傳穩(wěn)定性較高，但是也會出現(xiàn)較少的遺傳丟失現(xiàn)象，同時子代個體間也會出現(xiàn)一定的差異性[8]?；蚬こ叹倪z傳穩(wěn)定性直接影響重組蛋白的表達，分離純化，乃至后期的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[9]，為了獲得高表達的轉(zhuǎn)化株，本實驗對構(gòu)建的bFGF轉(zhuǎn)化株進行篩選及鑒定，實驗結(jié)果顯示重組畢赤酵母菌中挑取的共99個單克隆均為Mut+型，表型穩(wěn)定；且11個單克隆中有8個檢出目的基因，說明轉(zhuǎn)化株穩(wěn)定性較高；對8個檢出目的基因的單克隆進行bFGF表達能力篩選，表達能力各有不同，其中9d3表達量最高，發(fā)酵液表達量為13.14 ng/L。因此，適宜選取9d3作為后續(xù)大規(guī)模發(fā)酵的菌種。本研究對重組畢赤酵母菌進行了鑒定，并篩選出高表達菌株為后續(xù)大規(guī)模發(fā)酵提供菌種。