嚴 石,潘春剛,張 健,許 磊,宋 芳,潘京學,楊小蓉,劉兆環(huán),楊君敬

(1.中牧實業(yè)股份有限公司,北京 豐臺 100070；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室,北京 海淀 100095)

近年來,隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展,運用一系列的技術(shù)手段,已設(shè)計、制造出多種生物制品。其研發(fā)、生產(chǎn)過程大致包括上、下游兩個階段,上游是運用生物技術(shù)手段研制目標產(chǎn)物,下游是指對目標產(chǎn)物的料液進行前處理、濃縮純化等一系列過程。目前,生物制品上游技術(shù)發(fā)展較快,而下游分離純化技術(shù)發(fā)展相對滯后。許多生物制品在實驗室已研制成功,卻無法向工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的方向邁進。

獸用生物制品是作為生物技術(shù)領(lǐng)域的一類重要產(chǎn)品,就全球范圍而言,其市場一直保持著平穩(wěn)較快的增長,銷售額每年持續(xù)增加,市場需求量巨大。

1 國外獸用疫苗的現(xiàn)狀與優(yōu)勢

在國外,生物技術(shù)的進步推動著動物保健產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,同時應用于獸用制品領(lǐng)域,以此不斷推出功能更強、效果更好、副作用更低的生物制品,如：獸用疫苗。國外企業(yè)已研制出各類獸用疫苗已相繼投入市場,其產(chǎn)品主要在提高有效抗原含量方面研究的越來越深入,即在蛋白分離純化方面,處于絕對優(yōu)勢。

2 國內(nèi)獸用疫苗存在的問題

近年來,國外企業(yè)的獸用疫苗產(chǎn)品陸續(xù)投放到國內(nèi)市場,銷量不斷增加,其產(chǎn)品具有性狀穩(wěn)定、均一、安全、高效特點,使得國內(nèi)企業(yè)面臨巨大的生存壓力。在借鑒國外先進經(jīng)驗、技術(shù)的前提下,雖然我國獸用疫苗產(chǎn)業(yè)得到了一定程度的發(fā)展,仍普遍存在管理模式落后、基礎(chǔ)設(shè)施薄弱、生產(chǎn)條件不高等一系列問題。另外,各企業(yè)產(chǎn)品種類雖有所增加,仍存在產(chǎn)品結(jié)構(gòu)不合理、同質(zhì)化嚴重、科技創(chuàng)新程度不高的問題。部分企業(yè)由于對新工藝的開發(fā)研究和關(guān)注較少,導致部分產(chǎn)品的質(zhì)量不穩(wěn)定、雜蛋白含量高、抗原含量低、免疫保護率低等問題,基于上述原因,國內(nèi)企業(yè)亟待調(diào)整產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和工藝,以下游生產(chǎn)工藝為切入點,重點提高抗原有效含量、降低產(chǎn)品的雜蛋白含量為目標,開展純化工藝技術(shù)的研究。

由于獸用產(chǎn)品近幾年才開展分離純化技術(shù)與工藝,本人在借鑒人用產(chǎn)品、并與獸用產(chǎn)品結(jié)合,進行了純化技術(shù)工藝的綜述,為獸用疫苗抗原分離純化的研究與應用提供支持。

3 獸用抗原純化的方法

獸用疫苗抗原作為蛋白質(zhì),在組成成分、物理、化學、生物性狀等方面都存在著諸多差異,其對應的分離純化方法各異。首先要了解目標蛋白性狀諸如溶解度、分子大小、等電點、穩(wěn)定性、電荷差異等一系列性狀,再制定合理的分離純化步驟、方法,具體步驟、方法視產(chǎn)品而定。

3.1 獸用抗原的前處理 分離純化目標蛋白首先要將其從原組織或細胞中釋放出來,并保持原有的活性。根據(jù)目標料液性質(zhì)不同,采取前處理的方式不同。例如,機械破碎法、滲透破碎法、反復凍融法、超聲波振蕩、研磨、高壓擠壓或酶處理等方法,破碎后,選擇適當緩沖系統(tǒng)將目標蛋白提取出來,細胞碎片等大顆粒不溶物通過離心、過濾或者微濾的方法除去。

3.2 獸用抗原的分離純化

3.2.1 根據(jù)分子大小不同進行分離純化 蛋白質(zhì)作為一類重要的生物大分子,根據(jù)不同分子大小,可以利用一些方法使其和其他物質(zhì)分開,達到分離的目的。主要有透析、超濾、密度梯度離心和凝膠過濾等。

透析過濾是分離常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜制成透析袋中,再浸入透析液達到分離的目的。

超濾是一種加壓膜分離技術(shù),即在一定的壓力下,使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜,而使大分子溶質(zhì)不能透過,留在膜的一邊,從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。王繼華等[1]在口蹄疫二價滅活疫苗抗原濃縮純化工藝中使用超濾技術(shù)可有效降低免疫副反應。劉國英[2]在偽狂犬病抗原純化濃縮工藝研究中使用超濾技術(shù)濃縮10倍雜蛋白去除率約90%。

密度梯度離心是用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成-連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度,將蛋白混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部,通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫、蔗糖和多聚蔗糖。有報道Barteling等[3]建立的定量口蹄疫病毒146S蔗糖密度梯度離心法。另外高順平[4]等通過蔗糖密度梯度離心技術(shù)純化山羊痘病毒,病毒得到有效富集,病毒顆粒完整。

凝膠過濾又稱分子排阻層析,利用某些凝膠對不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異而進行分離的一門層析技術(shù)。原理是把不同目標蛋白流經(jīng)凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內(nèi)結(jié)構(gòu),被排阻珠外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動并最先流出柱外,比凝膠珠孔徑小的蛋白隨著溶劑在珠孔內(nèi)部的流動后流出柱外。目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。凝膠過濾在獸用疫苗產(chǎn)品應用得不多,主要集中在人用領(lǐng)域。

3.2.2 根據(jù)溶解度不同進行分離純化 影響目的蛋白溶解度的因素有很多,如溶液的pH值、離子強度、介電常數(shù)和溫度等。但在同一條件下,不同蛋白抗原結(jié)構(gòu)的不同溶解度各異,根據(jù)具體分子結(jié)構(gòu)的特點,適當?shù)母淖兺獠織l件,選擇性地控制目標蛋白溶解度,達到分離的目的。常用的方法有等電點沉淀、調(diào)節(jié)pH值、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機溶劑沉淀。

等電點沉淀和pH值調(diào)節(jié)是最常用的方法。每種蛋白抗原都有自己的等電點,在等電點時溶解度最低；另外有些蛋白抗原在一定pH值時很容易溶解,可以通過適時的調(diào)節(jié)溶液pH值來達到分離純化效果。

鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白溶解度的現(xiàn)象,其中,增加蛋白溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶,反之為鹽析。鹽溶有增加蛋白質(zhì)溶解度的作用,用適量鹽離子的緩沖液能從生物樣本中提取更多蛋白質(zhì)。鹽析是根據(jù)蛋白質(zhì)分子表面疏水基團含量不同,溶解度不同,被沉淀下來所需的中性鹽濃度不同。利用鹽溶和鹽析對蛋白進行提純后,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽。

有機溶劑沉淀指與水互溶的有機溶劑如甲醇、乙醇、丙酮,在高濃度下使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。在加入大量比水介電常數(shù)低的有機溶劑,蛋白質(zhì)表面水化層被破壞,蛋白質(zhì)沉淀析出。例如在冰浴中磁力棒攪拌下,在4℃預冷的培養(yǎng)液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[5]。冷乙醇法是目前WHO規(guī)程和中國生物制品規(guī)程推薦的方法,不僅分辨率高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[6]。值得注意的是,在室溫下,有機溶劑引起蛋白的沉淀同時,容易變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,不斷攪拌加入,防止其變性。

3.2.3 根據(jù)電荷不同進行分離純化 根據(jù)目標蛋白的電荷性質(zhì)不同,分離方法有電泳和離子交換層析兩類。

在外電場的作用下,帶電顆粒將向著與其電性相反的電極方向移動,這種現(xiàn)象稱為電泳。包括如下幾種常用的電泳技術(shù)：聚丙烯酰胺電泳是一種以聚丙烯酰胺凝膠為介質(zhì)的區(qū)帶電泳,常用于分離蛋白質(zhì)。它的優(yōu)點是設(shè)備簡單、操作方便、樣品用量少。等電聚焦電泳是根據(jù)蛋白質(zhì)等電點不同而分離、鑒定蛋白質(zhì)的一種電泳技術(shù),既可分離蛋白質(zhì),也可以用于蛋自質(zhì)的等電點測定。孫臣忠等[7]研究了聚丙烯酰胺電泳、等電聚焦電泳在分離純化蛋白質(zhì)中應用。雙向電泳是一種在二維方向上對同一蛋白樣品先后進行不同性質(zhì)的電泳,目的是分離高分辨率的蛋白質(zhì)。

離子交換層析是以離子交換劑為固定相,依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結(jié)合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換層析中,基質(zhì)由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂；反之為陽離子交換樹脂。離子交換層析同樣可以用于目標蛋白的分離純化。

3.2.4 根據(jù)生物分子的特異親和力進行分離純化 親和層析是利用生物大分子與某些相對應的專一分子特異識別和可逆結(jié)合的特性而建立起來的一種分離生物大分子的層析方法。只需一步處理即可得到純度較高的某種蛋白質(zhì)。它是根據(jù)不同蛋白質(zhì)對特定配體的特異而非共價結(jié)合的能力不同進行蛋白質(zhì)分離的。近年來,親和層析技術(shù)被廣泛應用于靶標蛋白,特別是在融合蛋白的分離純化上,因為融合蛋白具有特異性結(jié)合能力[8]。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[9]。范繼業(yè)等[10]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶的回收率達到62.5%。

3.2.5 根據(jù)蛋白質(zhì)吸附特性分離蛋白質(zhì) 疏水層析利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進行分離。該方法基于的是蛋白質(zhì)的疏水差異,在高鹽溶液中,蛋白質(zhì)與疏水配基相結(jié)合,而其他的雜蛋白則沒有此種性質(zhì),利用此種性質(zhì),可以將蛋白質(zhì)初步的分離,用于鹽析之后的蛋白質(zhì)進一步提純。

4 結(jié)語

在實際工作中,很難用單一的方法來實現(xiàn)目標蛋白的分離純化,往往要綜合幾種方法才能分離出一種目標蛋白。理想的分離提純方法,要求產(chǎn)品純度和回收率越高越好,但實際上兩者難以兼顧,因此,考慮分離提純的條件和方法時,在兩者之間作適當?shù)倪x擇。