益生菌中乳酸菌概況及檢測技術(shù)的研究進展

周莉，平洋，譚靜，張亞勛，羅蓓蓓

(河南省商業(yè)科學研究所有限責任公司，鄭州 450002)

1 益生菌概述

益生菌(probiotics)的概念最早源于希臘語，意為“對生命有益”。2001年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織將益生菌定義為“當活性微生物足量且給予宿主健康益處”。但是由于“健康益處”這一概念太過于模糊，世界衛(wèi)生組織將其進一步補充為“對主體的益處必須實現(xiàn)，并且被證明超過安慰補償劑的范圍”[1]。益生菌是指通過改善人類腸道菌群進而改善人體健康狀況的一類活菌，但不是所有的有益菌都稱得上是益生菌，要想成為益生菌需符合以下條件：能夠耐受胃液、膽汁的腐蝕；在腸內(nèi)是存活狀態(tài)且能增殖；能夠改善腸內(nèi)菌群；保證安全性；活菌狀態(tài)且含一定菌數(shù)；經(jīng)濟實惠且容易處理[2]。益生菌不僅具有改善食品風味，延長食品保質(zhì)期，提高食品營養(yǎng)價值的功能，而且其還具有調(diào)節(jié)胃腸道菌群正常和維持人體腸道衛(wèi)生平衡的功能[3]。益生菌在益生菌飲品、益生菌制劑和膳食添加劑中應用廣泛，如益生菌飲料乳制品和益生菌膠囊等。

1.1 益生菌中乳酸菌概述

對于益生菌的研究，越來越多的學者將各種食品與益生菌結(jié)合起來，將益生菌添加到不同食物中進行研究[4，5]。在所有益生菌中, 目前研究得最深入、最受重視的一類當屬乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB), 乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細菌的統(tǒng)稱。它是一種有利于機體健康的微生物，革蘭氏陽性桿菌或球菌,獲得能量的方式是發(fā)酵碳水化合物,從而產(chǎn)生乳酸。它不僅能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,并產(chǎn)生抑菌代謝產(chǎn)物，抑制腐敗菌的生長。并通過與腐敗菌競爭生長環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)、代謝抑菌素等方式,加強腸道生物的屏障功能，促進了食品的安全性和人類健康。因此，乳酸菌在食品行業(yè)的開發(fā)應用已成為熱點，該領(lǐng)域的發(fā)展對促進人類健康，提升人類健康生活水平具有重大意義。

1.2 乳酸菌分類

乳酸菌作為一類能夠?qū)λ拗魃砉δ墚a(chǎn)生有益作用的活性微生物，數(shù)量巨多，除極少數(shù)外，絕大部分都是人體內(nèi)必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其廣泛存在于人體的腸道中。目前，乳酸菌分為許多種屬，它們各有其不同的特性，從食品應用和保健作用來說，目前開發(fā)的菌株尚不多[6]。目前在食品中常用的主要分為3類，即雙歧桿菌屬、乳桿菌屬和鏈球菌屬。乳酸菌分類及其功能見表1。

1.3 乳酸菌的主要生理功能

益生菌進入人體腸道后，與腸內(nèi)其他微生物產(chǎn)生了一系列復雜關(guān)系并最終達到促進宿主健康的目的。益生菌的主要生理功能如下。

1.3.1 生物屏障作用

益生菌產(chǎn)生的有機酸、細菌素和蛋白質(zhì)可以改變細菌細胞膜的通透性，調(diào)節(jié)腸道pH值，抑制有害菌的生長繁殖；益生菌的表面分子與宿主上皮細胞分子識別受體相結(jié)合，從而調(diào)節(jié)腸道屏障功能[7]。

1.3.2 調(diào)節(jié)腸道菌群平衡

腸道內(nèi)各種微生物相互作用，腸道內(nèi)部分乳酸菌不受外界菌株影響，有一套自我平衡系統(tǒng)，而后迅速增殖形成優(yōu)勢菌，并抑制致病菌繁殖。嗜熱鏈球菌能夠抑制病原菌生長，防止壞菌滋生，治療疾病，改善腸道微環(huán)境[8]；長雙歧桿菌具有調(diào)節(jié)腸道功能紊亂，維護腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)作用[9]。

1.3.3 營養(yǎng)吸收

益生菌在動物體內(nèi)還可產(chǎn)生多種消化酶如淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶等，它們促進了營養(yǎng)物質(zhì)特別是下消化道營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。乳酸菌不僅可以產(chǎn)生多種酶類，而且能通過產(chǎn)酸，提高鈣、磷、鐵的利用率，還能促進維生素D的吸收和利用[10]。

1.3.4 免疫調(diào)節(jié)

阻止外界環(huán)境中的病原菌入侵，能夠有效地提高干擾素和巨噬細胞的活性，參與調(diào)解細胞吞噬功能中細胞因子的分泌及宿主和抗原之間的免疫反應，進而提高機體對致病菌的免疫力[11]。

1.3.5 抗衰老、抗癌作用

具有抗膽固醇功能，能明顯減少腸管對膽固醇的吸收，同時促進膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懰猁}，從而加快其排出體外，對延緩機體衰老有積極作用。嗜酸乳桿菌能夠增加腸道內(nèi)益生菌的數(shù)量及生命力，并且具有一定的抗癌作用；嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌共同培養(yǎng)，其抗癌活性顯著增強，癌細胞的增殖顯著降低[12]。

2 新型檢測技術(shù)

目前，乳酸菌鑒定大多仍沿用傳統(tǒng)方法，但是傳統(tǒng)分析法存在一定缺陷：步驟繁瑣，費時費工，并且對于選擇性培養(yǎng)基的質(zhì)量要求嚴格，靈敏度低。受操作者經(jīng)驗影響較大，難以滿足市場精確鑒定和定量的要求。

2.1 免疫學技術(shù)

胡陸軍[13]利用ELAA(酶聯(lián)適配體測定)方法，針對短雙歧桿菌，線性關(guān)系為y=0.0588x+0.3423(R2=0.984)，檢測范圍為103～107CFU/mL，檢測限可以達到103CFU/mL。針對兩歧雙歧桿菌，線性關(guān)系為y=0.07663x+0.1471(R2=0.983)，檢測范圍為104～107CFU/mL，檢測限為104CFU/mL。

袁耀武等[14]通過動物免疫方法制備了鼠抗長雙歧(B.longum)和兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)的免疫血清及兔抗長雙歧和兩歧雙歧桿菌的免疫血清，經(jīng)雙夾心ELISA法對雙歧桿菌發(fā)酵乳制品中雙歧桿菌進行檢測，檢測最低濃度可達107CFU/mL，僅耗時8 h。

2.2 qPCR技術(shù)

發(fā)酵乳制品中副干酪乳桿菌先經(jīng)PMA處理后，采用沸水浴的方法提取副干酪乳桿菌基因組，然后通過qPCR方法檢測發(fā)酵乳制品中的活菌[15]。結(jié)果副干酪乳桿菌經(jīng)90 ℃處理6 min，即為膜損傷菌；PMA能夠抑制107CFU/mL死菌DNA的擴增，而不影響活菌DNA的擴增；PMA-qPCR能夠準確檢測到樣品中的活菌。

2.3 基因組學分析法

李柏良等[16]基于Illumina Hiseq 2500與Pacbio RSII測序平臺對嗜熱鏈球菌KLDS SM進行全基因組測序并繪制基因組圖譜，結(jié)果表明:菌株KLDS SM的基因組由一個1856787 bp環(huán)狀染色體組成，GC含量為39.08%，含有1732個蛋白質(zhì)編碼基因；菌株KLDS SM具有完整的蛋白水解系統(tǒng)和8種氨基酸的合成能力；15株嗜熱鏈球菌在氨基酸合成方面相對保守，僅在組氨酸合成途徑方面存在較大的差異。

趙潔[17]采用Illumina Hiseq高通量測序平臺完成了185株分離自國內(nèi)外自然發(fā)酵乳中嗜熱鏈球菌的全基因組重測序，引入全基因組關(guān)聯(lián)分析完成了嗜熱鏈球菌的功能基因組學研究，建立了嗜熱鏈球菌的核心基因集和泛基因集，結(jié)果揭示了高突變率主要發(fā)生在嗜熱鏈球菌基因組的假基因區(qū)和基因間區(qū)，并通過全基因組關(guān)聯(lián)分析挖掘出與嗜熱鏈球菌表型特征相關(guān)的功能基因。

2.4 實時熒光定量PCR

陳臣等[18]利用SMM系統(tǒng)篩選植物乳桿菌種特異序列，根據(jù)特異序列設計引物進行實時熒光定量PCR反應，檢測限為2.26×102CFU/mL。該方法快速靈敏,可以在實際生產(chǎn)中應用。

肖其勝等[19]根據(jù)雙歧桿菌屬16S rRNA基因的保守區(qū)域設計特異性引物和探針，建立了食品中雙歧桿菌屬的實時熒光聚合酶鏈式反應PCR檢測方法。DNA檢測絕對靈敏度可達到2 pg，相對靈敏度可達到104CFU/mL。重復性測試表明相對標準偏差小于1%。

張娜娜等[20]根據(jù)嗜酸乳桿菌NCFM的SPIDR保守區(qū)域設計特異性引物與探針，靈敏度達到3 pg,相對靈敏度達到103CFU/mL；重復性檢測表明標準偏差在2.6%以下。標記嗜酸乳桿菌的樣品全部檢測出嗜酸乳桿菌且含量在5.83×102～3.68×104CFU/mL。

包秋華等[21]根據(jù)乳酸菌的16S rDNA基因序列設計嗜酸乳桿菌種特異性引物，應用種特異性PCR和實時熒光定量PCR反應，通過瓊脂糖凝膠電泳圖譜和實時熒光定量PCR圖譜分析，建立快速、準確地檢測發(fā)酵乳中的定量和定性方法。

2.5 磁珠捕獲法

Mullane N R等[22]使用陽離子磁珠捕獲法檢測嬰幼兒配方粉(infant formula milk，IFM)中的阪崎腸桿菌：均質(zhì)1 min，BPW增菌6 h，陽離子捕獲，然后培養(yǎng)，如此可在較短時間內(nèi)可靠檢測IMF中1～5 CFU/500 g的阪崎腸桿菌。

2.6 LAMP技術(shù)

胡連霞等[23]采用改良環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術(shù)檢測PIF中的阪崎腸桿菌。以阪崎腸桿菌新屬菌種(ATCC29544)的16S～23S rDNA間區(qū)序列作為靶序列，設計內(nèi)外引物和環(huán)引物，通過肉眼觀察白色沉淀，判斷檢測結(jié)果。LAMP檢測阪崎腸桿菌的靈敏度為0.10 CFU/mL，人工污染阪崎腸桿菌的IFM的檢出限為1.1 CFU/g。

2.7 DHPLC技術(shù)

楊春華等[24]應用PCR結(jié)合變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)建立食品中阪崎腸桿菌的快速檢測方法，根據(jù)阪崎腸桿菌16S～23S rDNA特異基因序列的特點設計特異性引物，PCR擴增的產(chǎn)物經(jīng)DHPLC技術(shù)進行快速檢測。檢測低限可達到25 CFU，且具有很好的特異性。

2.8 PCR-DGGE技術(shù)

王營等[25]應用PCR-DGGE技術(shù)，并結(jié)合種特異性PCR技術(shù)檢測酸奶中的乳酸菌組成。優(yōu)化DGGE檢測相關(guān)條件，結(jié)果表明最佳DGGE條件為:凝膠變性梯度范圍30%～60%，電泳時間300 min。利用上述條件能有效區(qū)分植物乳桿菌、乳雙歧桿菌,但是無法區(qū)分保加利亞乳桿菌與嗜酸乳桿菌，嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌與干酪乳桿菌;在此結(jié)果基礎(chǔ)上，再采用種特異性PCR技術(shù)，能夠有效區(qū)分上述存在共遷移現(xiàn)象的菌株。

2.9 T-RFLP技術(shù)

張思璐等[26]采用源于16S～23S rRNA基因間隔區(qū)序列的乳酸桿菌屬特異性引物LAB-rev，乳酸桿菌的屬特異性引物，6-FAM熒光標記后結(jié)合16S上游通用引物7f用于乳酸桿菌的PCR擴增。選取HaeⅢ和HhaⅠ進行限制性酶切，最后對酶切后的產(chǎn)物末端測序得到T-RFLP峰譜圖，成功搭建T-RFLP技術(shù)用于微生態(tài)環(huán)境中乳酸桿菌檢測的平臺。

2.10 MLST方法

劉文俊[27]應用傳統(tǒng)實驗室發(fā)酵方法對43株嗜熱鏈球菌和39株保加利亞乳桿菌進行了酸奶發(fā)酵實驗，同時應用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌與發(fā)酵、產(chǎn)酸和風味形成特性相關(guān)的功能基因多位點序列分型(MLST)方法，進行菌株系統(tǒng)發(fā)育和遺傳進化研究。結(jié)果表明：43株嗜熱鏈球菌的發(fā)酵時間在4.5～24.5 h，19株菌發(fā)酵時間小于10 h，其中10株菌的產(chǎn)酸速率在10° T/h以上。39株保加利亞乳桿菌的發(fā)酵時間在8.5～24.5 h，23株菌的發(fā)酵時間小于15 h，其中有14株菌的產(chǎn)酸速率在3° T/h以上。

2.11 流式細胞技術(shù)

程志才等[28]添加熒光標記QEPV的M17培養(yǎng)基培養(yǎng)嗜熱鏈球菌，采用流式細胞術(shù)檢測QEPV能否被嗜熱鏈球菌吸收。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，F(xiàn)AM-QEPV與FITC-QEPV能夠穿過嗜熱鏈球菌細胞膜，推測QEPV能夠被嗜熱鏈球菌吸收、利用。并且0.5 mg/mL的QEPV能有效促進嗜熱鏈球菌的生長繁殖，提高嗜熱鏈球菌的發(fā)酵能力。

2.12 色差分析法

王佳等[29]借助細菌總數(shù)快速檢測儀對加入指示劑后的樣品顏色(RGB)變化進行檢測，建立了色差值b值與嗜熱鏈球菌數(shù)目之間的標準方程，相關(guān)系數(shù)可達到0.9820。對標準曲線進行準確度分析，與國標計數(shù)法檢測結(jié)果差異不顯著。

3 總結(jié)

作為益生菌中重要的有益菌，在食品工業(yè)日益發(fā)達的今天，如何更好地將益生菌應用于食品工業(yè)中，使人們對益生菌中乳酸菌有更加清晰的認識，這是每一位科研工作者值得深思的問題。大量的研究已證實益生菌的重要性和功能性，然而它們最大的缺點是活菌期時間短。在今后的研究方向中，利用分子生物學技術(shù)和基因工程等手段進行基因改造，培育出功能強大、能長久定居腸道的益生菌，保持益生菌穩(wěn)定，并使益生菌達到足夠量從而充分發(fā)揮其益生作用是技術(shù)核心問題。提高乳酸菌菌體的生理功能穩(wěn)定性，減少發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的不穩(wěn)定性，使益生菌長期保存也是熱門研究方向。相信隨著研究的深入，益生菌能夠在未來給人類的健康和社會的發(fā)展帶來更大益處，具有廣闊的開發(fā)和應用前景。