不同產(chǎn)地及不同年份艾葉中綠原酸含量差異分析

李超 黃顯章 張超云

摘要：采用響應(yīng)面法優(yōu)化艾葉綠原酸提取工藝，分析河南湯陰、河北保定、河南南陽(yáng)、浙江寧波、湖北蘄春5個(gè)不同產(chǎn)地及2013—2017年河南湯陰艾葉中綠原酸含量的差異。結(jié)果表明，艾葉綠原酸最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)37%、提取時(shí)間60 min、料液比1 g ∶ 15 mL;河北保定艾葉中綠原酸含量相對(duì)最高，為10.65%，顯著高于河南湯陰、河南南陽(yáng)、浙江寧波等產(chǎn)區(qū)（P﹤0.05）;2017年河南湯陰艾葉中的綠原酸含量相對(duì)最高，為10.22%，顯著高于2013—2016年的。5個(gè)艾葉不同主產(chǎn)區(qū)及2013—2017年這5個(gè)不同年份艾葉中的綠原酸含量差異相對(duì)較大，在臨床使用中應(yīng)區(qū)別對(duì)待，以保證用藥的安全性和有效性。

關(guān)鍵詞：艾葉;響應(yīng)面法;綠原酸;產(chǎn)地;年份;提取工藝

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）22-0251-04

艾葉為菊科植物艾（Artemisia argyi Lévl. et Vant.）的干燥葉，正式作為藥物最早記載于我國(guó)梁朝陶弘景的《名醫(yī)別錄》，現(xiàn)收載于各版《中國(guó)藥典》中[1-2]。艾葉性辛、溫，味苦，歸肝、脾、腎經(jīng)，具有溫經(jīng)止血、散寒止痛、理氣安胎等功效，距今已有2 000余年的使用歷史[3-6]。在臨床應(yīng)用中，艾葉內(nèi)服溫經(jīng)止血、散寒止痛，外用殺蟲(chóng)止癢、清熱除濕，常用于治療胎漏下血、少腹冷痛、經(jīng)寒不調(diào)等癥狀，是止血的要藥之一，為中醫(yī)婦科常用藥物[7-8]。隨著對(duì)艾葉研究的逐漸深入，其制品應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，艾葉作為灸法的主體材料，是歷代醫(yī)學(xué)家們多次臨床實(shí)踐的選擇，以艾葉為主開(kāi)發(fā)的艾附暖宮丸、安陽(yáng)固本膏等復(fù)方中成藥也在臨床中被廣泛應(yīng)用。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)艾葉的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用及臨床療效等方面[9-13]，對(duì)不同產(chǎn)地、不同年份間的艾葉品質(zhì)差異鮮見(jiàn)研究報(bào)道。本試驗(yàn)在利用響應(yīng)面法優(yōu)化艾葉綠原酸最佳提取工藝的基礎(chǔ)上，分析湖北蘄春、浙江寧波、河南湯陰、河北保定、河南南陽(yáng)5個(gè)不同產(chǎn)地及2013—2017年河南湯陰艾葉中的綠原酸含量差異，以期為艾葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供試驗(yàn)依據(jù)和有益參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

721-100型紫外可見(jiàn)光分光度計(jì)、SHB-DII型循環(huán)真空抽濾系統(tǒng)、粉碎打粉機(jī)，上海儀電分析儀器有限公司生產(chǎn);DKB-507型恒溫干燥烘箱，天津市蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn);DS-2120QT型超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司生產(chǎn);Thermo fisher移液器，賽默飛世爾科技生產(chǎn);AR-1106型電子分析天平，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)生產(chǎn);4號(hào)藥典篩，湖南通用藥篩廠生產(chǎn)。無(wú)水乙醇，批號(hào)170506，南京國(guó)碩醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn);綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，北京振翔科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 樣品采集

浙江寧波、河北保定、河南湯陰、河南南陽(yáng)、湖北蘄春5個(gè)產(chǎn)地艾葉樣品，分別于2017年端午節(jié)前后采集;2013—2017年5個(gè)不同倉(cāng)儲(chǔ)年限艾葉樣品，分別于當(dāng)年端午節(jié)前后采集于河南省湯陰縣伏道鎮(zhèn)。艾葉樣品采集時(shí)按照“Z”形進(jìn)行，采集樣品經(jīng)南陽(yáng)理工學(xué)院黃顯章副教授鑒定為菊科植物艾Artemisia argyi Lévl.et Vant.。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取干燥至恒質(zhì)量的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5.50 mg，置于100 mL容量瓶中，加乙醇溶液溶解;定容，搖勻，得綠原酸對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度為0.055 mg/mL;精確吸取綠原酸對(duì)照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加入乙醇定容，混合均勻，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為327 nm處的吸光度;以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=8.225 9X+0.005 5（r2=0.998 8），說(shuō)明綠原酸質(zhì)量濃度與吸光度存在良好的線性關(guān)系。

1.3.2 艾葉綠原酸提取單因素試驗(yàn) 在相對(duì)固定乙醇濃度為40%、超聲時(shí)間為60 min、料液比為1 g ∶ 15 mL、提取溫度60 ℃其中3個(gè)因子的條件下，分別考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、料液比、提取溫度對(duì)艾葉綠原酸提取率的影響。乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)6個(gè)梯度，分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%;超聲時(shí)間設(shè)5個(gè)梯度，分別為30、60、90、120、180 min;料液比設(shè)5個(gè)梯度，分別為1 ∶ 5、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 30（g ∶ mL）;提取溫度設(shè)5個(gè)梯度，分別為20、40、60、80、99 ℃。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化艾葉綠原酸提取工藝 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken中心組合原理，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、料液比為考察因素，采用3因素3水平響應(yīng)面分析法（-1、0、1）進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，詳見(jiàn)表1、表2，以測(cè)定艾葉中綠原酸含量，優(yōu)化艾葉綠原酸提取工藝。

1.3.4 不同產(chǎn)地、不同年份艾葉中綠原酸含量的測(cè)定 將采集的不同產(chǎn)地、不同年份艾葉樣品去雜、清洗，自然干燥，烘干，粉碎過(guò)篩，備用;采取響應(yīng)面法得到的最佳提取工藝（乙醇體積分?jǐn)?shù)37%、料液比為1 g ∶ 15 mL、提取時(shí)間60 min）提取艾葉綠原酸，取適量待測(cè)液測(cè)定波長(zhǎng)為327 nm處的吸光度，計(jì)算艾葉中綠原酸含量及其提取率。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾葉綠原酸提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)艾葉綠原酸提取率的影響 由圖1可知，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，艾葉中綠原酸提取率呈先升后降趨勢(shì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)對(duì)艾葉綠原酸的提取率相對(duì)最高，為 9.07%，這說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加有利于艾葉中綠原酸的提取，但其持續(xù)升高可能影響溶劑的介電性能及極性，反而會(huì)使綠原酸提取率下降。因此，艾葉綠原酸提取使用的乙醇體積分?jǐn)?shù)以40%為宜。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)艾葉綠原酸提取率的影響 由圖2可知，隨超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，艾葉中綠原酸提取率呈先升后降趨勢(shì)，提取時(shí)間為60 min時(shí)對(duì)艾葉綠原酸的提取率相對(duì)最高，為8.89%，這說(shuō)明超聲時(shí)間過(guò)少，會(huì)導(dǎo)致對(duì)綠原酸的提取不充分，而提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則可能會(huì)導(dǎo)致水溫升高或部分酚酸類(lèi)成分分解而影響對(duì)綠原酸的提取。因此，艾葉綠原酸提取的最佳時(shí)間以60 min為宜。

2.1.3 料液比對(duì)艾葉綠原酸提取率的影響 由圖3可知，隨料液比的下降，艾葉中綠原酸提取率呈先升后降趨勢(shì)，料液比為1 g ∶ 15 mL時(shí)對(duì)艾葉綠原酸的提取率相對(duì)最高，為9.25%。因此，艾葉綠原酸提取的料液比以1 g ∶ 15 mL為宜。

2.1.4 提取溫度對(duì)艾葉綠原酸提取率的影響 由圖4可知，隨提取溫度的升高，艾葉綠原酸提取率呈先升后降再升趨勢(shì)，其中以提取溫度為40 ℃時(shí)對(duì)艾葉綠原酸的提取率相對(duì)最高，為9.04%。因此，考慮到實(shí)際操作需要和節(jié)能減排，艾葉綠原酸的提取溫度以40 ℃為宜，響應(yīng)面分析中也以此溫度作為提取溫度。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化艾葉綠原酸提取工藝

由表2可見(jiàn)，提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比 1 g ∶ 15 mL、提取時(shí)間60 min時(shí)，艾葉中綠原酸提取率相對(duì)最高，為9.04%。試驗(yàn)結(jié)果（表2、圖5）經(jīng)回歸統(tǒng)計(jì)，得回歸方程為：Y=3.517 5+0.074X1+0.308 33X2+0.415 5X3-2.666 67×10-4X1X2+1.05×10-3X1X3+2.133 33×10-3X2X3-10-3X21-4.444 44×10-4X22-0.019 2×X23， 確定系數(shù)（R2）為0.904 7，說(shuō)明艾葉綠原酸的試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值間有較好的一致性。由表3可見(jiàn)，試驗(yàn)因素中，一次項(xiàng)X1、二次項(xiàng)X21、X22、X23、交互項(xiàng)X2X3對(duì)回歸模型有極顯著影響（P<0.01），交互項(xiàng)X1X2、X1X3對(duì)回歸模型有顯著影響（P<0.05），這說(shuō)明試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系;回歸模型F值為78.33，達(dá)極顯著水平;失擬度P值為 0.19，大于0.05，模型失擬度不顯著。通過(guò)降維及解析回歸模型，得到艾葉綠原酸最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)36.96%、料液比為1 g ∶ 15.16 mL、提取時(shí)間為59.98 min。考慮到實(shí)際操作需要，將艾葉綠原酸最佳提取條件工藝修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)37%、料液比為1 g ∶ 15 mL、提取時(shí)間為60 min，此條件下實(shí)際測(cè)得艾葉綠原酸提取率為10.89%，而回歸模型預(yù)測(cè)提取率理論值為12.75%，實(shí)際測(cè)定值比理論預(yù)測(cè)值低1.86百分點(diǎn)，說(shuō)明該模型有較好的預(yù)測(cè)能力。

2.3 不同產(chǎn)地及不同年份艾葉樣品中綠原酸含量的測(cè)定

2.3.1 不同產(chǎn)地艾葉綠原酸含量差異 由表4可知，不同產(chǎn)地艾葉中綠原酸含量差異較大，河北保定的艾葉綠原酸含量相對(duì)最高，平均含量達(dá)到10.65%，稍高于湖北蘄春，顯著高于河南南陽(yáng)、河南湯陰、浙江寧波等產(chǎn)區(qū)的艾葉（P<0.05）;河南湯陰的艾葉綠原酸含量居中，平均含量為10.22%，顯著高于浙江寧波、 河南南陽(yáng)產(chǎn)區(qū)的艾葉;浙江寧波、河南南陽(yáng)的艾葉綠原酸含量相對(duì)較低，其含量分別為8.69%、8.32%。

2.3.2 不同年份艾葉綠原酸含量差異 由表5可知，隨貯藏年份的延長(zhǎng)，艾葉中綠原酸含量整體呈下降趨勢(shì);2017年的河南湯陰艾葉綠原酸含量相對(duì)最高，平均含量為10.22%，顯著高于其他年份（P﹤0.05）;2016、2015年的艾葉綠原酸平均含量分別為8.37%、8.00%，相互間差異不顯著（P>0.05），顯著高于2013、2014年的艾葉;2013、2014年的艾葉綠原酸含量相對(duì)較低，分別為7.19%、6.97%。

3 結(jié)論與討論

隨著艾產(chǎn)業(yè)的快速持續(xù)發(fā)展，艾葉已成為中藥和食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者多集中于化學(xué)成分、藥理作用及臨床療效等方面的研究，但對(duì)不同產(chǎn)地艾葉的有效成分含量是否存在差異、不同倉(cāng)儲(chǔ)年限對(duì)艾葉品質(zhì)是否有影響等問(wèn)題卻少有研究。河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在前期研究的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化艾葉綠原酸最佳提取工藝，并分析湖北蘄春、浙江寧波、河南湯陰、河北保定、河南南陽(yáng)5個(gè)不同產(chǎn)地及河南湯陰2013—2017年5個(gè)不同年份艾葉綠原酸含量的差異，結(jié)果表明，艾葉綠原酸最佳提取工藝條件乙醇體積分?jǐn)?shù)36.96%、料液比為1 g ∶ 15.16 mL、提取時(shí)間為 59.98 min，考慮到實(shí)際操作需要，將艾葉綠原酸最佳提取工藝條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)37%、料液比為1 g ∶ 15 mL、提取時(shí)間為60 min;不同產(chǎn)地艾葉中綠原酸含量差異較大，其中河北保定的艾葉綠原酸含量相對(duì)最高，達(dá)到10.65%，稍高于湖北蘄春，顯著高于河南南陽(yáng)、河南湯陰、浙江寧波等產(chǎn)區(qū)的艾葉（P<0.05），河南湯陰的艾葉綠原酸含量居中，為10.22%，顯著高于浙江寧波、河南南陽(yáng)產(chǎn)區(qū)的艾葉;不同年份艾葉中的綠原酸含量差異也較大，2017年河南湯陰的艾葉綠原酸含量相對(duì)最高，為10.22%，顯著高于其他年份，2013、2014年的艾葉綠原酸含量相對(duì)較低，分別為7.19%、6.97%，顯著低于其他年份的。

不同產(chǎn)地及不同年份的艾葉綠原酸成分含量存在明顯差異，這就要求在制劑生產(chǎn)和臨床應(yīng)用中須區(qū)別對(duì)待，以確保其安全與有效;隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，艾葉中的綠原酸含量整體呈逐漸降低的趨勢(shì)，與傳統(tǒng)認(rèn)為的“陳艾質(zhì)量較好”存在一定出入，這可能是由于陳艾主要用于艾灸，其質(zhì)量評(píng)價(jià)體系主要考慮燃燒熱值，而在臨床應(yīng)用中未考慮到艾葉中有效成分的變化，這須更為深入地探討研究。

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