【摘 要】目的：探討補腎活血湯對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨修復(fù)的影響。方法：將40只雄性SD大鼠隨機分為5組，即正常組、模型組、補腎活血湯高低劑量組及硫酸氨基葡萄糖陽性對照組，每組8只;采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)注射法建立SD大鼠OA模型;末次給藥后取大鼠血清、關(guān)節(jié)炎、軟骨組織;免疫吸附法（ELISA）法檢測血清及關(guān)節(jié)液中MMP-13，TNF-α及COMP的含量。結(jié)果：將OA模型組與正常對照組相比較，模型組血清及關(guān)節(jié)液中的炎性因子（MMP-13，TNF-α、COMP）均大幅度增加（P<0.05），與OA模型組相比補腎活血湯高低劑量組大鼠血清及關(guān)節(jié)液中MMP-13，TNF-α及COMP的含量明顯下降（P<0.05）。結(jié)論：六味骨痹湯可促進大鼠OA模型軟骨修復(fù)，其機制可能是通過降低大鼠血清和關(guān)節(jié)液中MMP-13，TNF-α等因子含量抑制軟骨破壞有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】補腎活血湯;骨關(guān)節(jié)炎;軟骨修復(fù);炎癥因子

本實驗通過觀察對OA模型大鼠灌胃使用臨床常用方劑——補腎活血湯，對其有關(guān)的炎性因子的抑制水平，從而進一步探究其修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的能力及其對應(yīng)機制。

1 一般資料

1.1 實驗動物

28天的清潔級SD大鼠（體重：79±10g），共40只，來源：延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院-實驗動物中心，合格證號為SCXK（吉）2016-007，常溫飼養(yǎng)，自由進食水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 實驗藥物及制備

熟地黃（20g）、菟絲子（20g）、補骨脂（20g）、杜仲（6g）、枸杞子（6g）、肉蓯蓉（6g）、山萸（6g）、獨活（6g）、沒藥（6g）、當(dāng)歸（6g）、紅花（3g）（均由長白山保護開發(fā)中心醫(yī)院藥房提供），將全部藥品使用粉碎機打碎成粉，使用乙醇水溶液（濃度為75%）進行提取，每次2h，反復(fù)進行5次，對提取液進行回收，并提取乙醇將其制成凍干粉，使用醫(yī)用生理鹽水將其溶解制成藥液（濃度200mg/mL）。

1.3 藥品及試劑

硫酸氨基葡萄糖膠囊（信東生技股份有限公司）。木瓜蛋白酶（上海鑫樂生物科技有限公司），TNF-α、MMP-3、COMP酶聯(lián)免疫試劑盒購于Sigma公司（美國）。

1.4 實驗儀器

H1650-W型臺式離心機（美國Therom公司）;酶聯(lián)免疫檢測儀（RT-2100C，美國）;BK46型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

2 方法

2.1 動物分組與OA模型制備

將40只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機隨機分為5組，即正常組、模型組、補腎活血湯高低劑量組及陽性對照組，每組8只。將OA模型組，補腎活血湯高低劑量組以及陽性對照組小鼠右膝關(guān)節(jié)注射使用木瓜蛋白酶進行模型制備。

2.2 治療

參考實驗藥理學(xué)中人體與實驗動物用藥劑量比值對本次使用的湯劑進行相應(yīng)換算，按比例使用生理鹽水對藥品進行稀釋溶解，補腎活血湯高低劑量組劑量分別為1mL/只、0.5mL/只，陽性對照組予藥物1mL/只;不進行藥物干預(yù)的正常組與OA模型組按1mL/只的劑量使用生理鹽水進行灌胃，為期4周。

2.3 標(biāo)本的制備方法

灌胃結(jié)束后，麻醉全部大鼠，將大鼠于固定板上固定，剪斷其尾部，用一次性注射器采集5ml血液，處死大鼠后對造模關(guān)節(jié)處實施剃毛消毒處理，對其注射生理鹽水（1mL）并充分活動關(guān)節(jié)，回收沖洗液（不少于6mL）于1.5mL的Tube管內(nèi)使用4度離心機離心收集上清液，-80℃冰箱保存。

2.4 細胞因子的檢測

使用相應(yīng)試劑盒檢測樣本上清液中MMP-13，TNF-α及COMP的含量，其步驟應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒說明書[9]。使用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算炎性因子的含量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

SPSS17.0軟件進行相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理。全部計量資料以表示，兩組間差異用t檢驗，使用單因素方差分析確定多組間比較，當(dāng)P<0.05時有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清及關(guān)節(jié)液中炎性細胞因子含量

與正常組相比OA模型組血清及關(guān)節(jié)炎中MMP-13，TNF-α及COMP的數(shù)值表達增高（P<0.05）;與模型中相比經(jīng)藥物治療后的大鼠血清及關(guān)節(jié)炎MMP-13，TNF-α及COMP水平下降（P<0.05）（表1表2）。

4 討論

OA屬于中醫(yī)學(xué)“骨痹”“痹癥”范疇，補腎活血湯出自清代趙竹泉的《傷科大成》，活血通絡(luò)止痛，補調(diào)肝腎，強筋壯骨，可從根本上治療本病[7-9]。本研究是通過觀察補腎活血湯對大鼠血清及關(guān)節(jié)炎中MMP-13，TNF-α及COMP含量影響，進一步評價該湯劑對OA大鼠變態(tài)反應(yīng)的治療效果。

目前OA的發(fā)病機制尚不明確，多數(shù)研究者認為其發(fā)生是關(guān)節(jié)軟骨細胞及細胞外基質(zhì)、軟骨下骨質(zhì)三者降解與合成失衡的結(jié)果[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)多種因子在OA的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可作為反映關(guān)節(jié)軟骨損傷或修復(fù)的標(biāo)志。其中TNF-α與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，免疫性疾病TNF-α水平明顯增高，與膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎病變和軟骨退變密切相關(guān)，它可提高MMP-13 的基因表達，特異性降解Ⅱ型膠原纖維，從而破壞軟骨結(jié)構(gòu)[13]。除此之外，關(guān)節(jié)軟骨受到損傷時COMP會從軟骨釋放到關(guān)節(jié)液并吸收入血，故關(guān)節(jié)液及血清中COMP的含量也可反映反映軟骨的破壞程度[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用不同劑量的補腎活血湯干預(yù)后，較模型組相比補腎活血湯組大鼠血清及關(guān)節(jié)液中炎性細胞計數(shù)MMP-13，TNF-α及COMP水平下降，說明補腎活血湯緩解了OA大鼠關(guān)節(jié)的炎性反應(yīng)。故推測麻黃發(fā)表湯是通過減輕MMP-13，TNF-α及COMP水平，從而達到治療OA的目的。

參考文獻

[1]李樹明.中醫(yī)治療膝骨性關(guān)節(jié)炎臨床療效觀察[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2014，6（27）：18-19.

[2]魏合偉，鄭維蓬.膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)證型與關(guān)節(jié)軟骨損傷相關(guān)性分析[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，17（4）：7-9.

[3]Ashman O，Phillips AM.Treatment of non-unions with bone defects：which option and why？[J]. Injury，2013，44（Suppl1）：43-45.

[4]張迅超.補腎活血湯對骨折愈合的影響及其分子機制的研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[5]劉亞梅，王斌，羅毅文，等.補腎活血法調(diào)控大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖活性的實驗研究[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2015，23（3）：1-4.

[6]衛(wèi)彥強，石繼祥，紀(jì)斌，等.骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2018，24（5）：838-842.

[7]張延輝，高春陽，李少華.骨性關(guān)節(jié)炎患者退變軟骨及滑膜組織中細胞因子的表達[J].中國組織工程研究，2013，17（37）：6671.

[8]喬長峰，楊開舜.MMP-13、TIMP-1在兔骨關(guān)節(jié)炎模型的表達及其意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2009，47（3）：39-41.

[9]李姍姍，王秀華.中醫(yī)藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜病變及藥理實驗研究簡況[J].實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2012，26（18）：99，102.

[10]沙湖，楊莉.骨關(guān)節(jié)炎病理變化研究進展[J].實用醫(yī)院臨床雜志，2011，8（2）：180.

[11]劉新，黃文瑤，李衛(wèi)國，等.TLR-4、IL-1與膝骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)性的臨床研究[J].中華關(guān)節(jié)外科雜志，2013，7（4）：37-40.

[12]李靖揚，加亨，喬為民.獨活寄生湯聯(lián)合塞來昔布對.

[13]膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)液IL-1β、TNF-α及MMP-3的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，24（25）： 2780-27.

作者簡介

張鑫，男，長白山保護開發(fā)中心醫(yī)院副主任醫(yī)師，長期從事中醫(yī)骨傷方面的研究。