優(yōu)良梨汁發(fā)酵乳酸菌的篩選與發(fā)酵性能分析

焦媛媛，杜麗平，孫 文，魏金艷，馬立娟，肖冬光

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

乳酸菌發(fā)酵食品的歷史由來已久，近幾年關(guān)于乳酸菌發(fā)酵水果或蔬菜飲料的研究逐漸增多，經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵不僅提高果蔬本身營養(yǎng)價值，延長保鮮時間、增加保健作用，還可以改善風(fēng)味[1-4]。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸及其他有機酸，這賦予了發(fā)酵底物豐富的口感和營養(yǎng)功效。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是影響果蔬飲料質(zhì)量的重要因素，風(fēng)味物質(zhì)主要來源于原料本身和乳酸菌發(fā)酵后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，良好獨特的風(fēng)味使發(fā)酵食品更容易被接受[5-7]。Filannino等[8]選用植物乳桿菌接種有機石榴汁，開發(fā)出一款風(fēng)味和健康功效俱佳的發(fā)酵石榴汁產(chǎn)品。張亞雄等[9]采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌種進行單一果蔬汁及復(fù)合果蔬汁發(fā)酵。鄒玉紅等[10]以保加利亞乳酸桿菌和嗜熱酸鏈球菌混菌比例1∶1發(fā)酵蘋果、胡蘿卜混合果汁，并對發(fā)酵飲料的生產(chǎn)工藝進行了研究。劉磊等[7]利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌對龍眼發(fā)酵，結(jié)果顯示乳酸菌發(fā)酵可顯著增加龍眼果漿的總酸及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，利于開發(fā)風(fēng)味獨特的龍眼乳酸菌飲料新產(chǎn)品。Yoon等[11]采用4 種乳酸菌混合發(fā)酵西紅柿汁，經(jīng)過72 h發(fā)酵后其pH值下降至4.1，酸度增加了0.65%。

梨含有豐富的糖、有機酸和多種維生素、鈣、鐵、錳、鋅、氨基酸等，具有生津止渴、潤燥化痰、潤腸通便、降低血壓、養(yǎng)陰清熱、促進食欲、幫助消化等功效[12-13]。如今國內(nèi)市場上，用于梨或其他水果發(fā)酵的菌種均以引進自國外的一些商業(yè)乳酸菌為主，對發(fā)酵材料和發(fā)酵環(huán)境的適用性差，生產(chǎn)的梨汁等水果發(fā)酵飲品質(zhì)量參差不齊。影響發(fā)酵質(zhì)量的因素包括原材料、發(fā)酵菌種、發(fā)酵條件、產(chǎn)品風(fēng)味等，因此，選擇能適應(yīng)發(fā)酵條件且風(fēng)味優(yōu)良的菌種尤為關(guān)鍵[14-15]。本實驗對分離自水果發(fā)酵液和其他不同來源的10 株乳酸菌進行研究，從中篩選出適應(yīng)梨汁發(fā)酵條件的乳酸菌作為發(fā)酵菌株，并通過純種發(fā)酵對發(fā)酵過程中活菌數(shù)、pH值、有機酸和揮發(fā)性成分進行檢測，進一步優(yōu)選出性能優(yōu)良的乳酸菌作為梨汁的發(fā)酵菌株，這不僅為開發(fā)新的梨汁發(fā)酵產(chǎn)品提供了可能，同時也豐富了水果發(fā)酵專用菌種庫。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

新鮮水晶梨 市購；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ZG1，分離自酸菜發(fā)酵液；植物乳桿菌ZG2，分離自蘋果、梨混合發(fā)酵液；副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）BGG1，分離自蘋果、梨混合發(fā)酵液；副干酪乳桿菌BGG2，分離自雪蓮菌；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）GG2，分離自雪蓮菌；干酪乳桿菌GG8，分離自白酒酒糟；戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）WQ1，分離自梨、香蕉混合發(fā)酵液；戊糖片球菌WQ2，分離自木瓜發(fā)酵液；魏斯氏菌（Weissella）WS，分離自梨、香蕉混合發(fā)酵液；檸檬明串珠球菌（Leuconostoc citreum）NQ，分離自雪蓮菌。菌株均由天津科技大學(xué)現(xiàn)代釀造實驗室保藏。

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，硫酸錳0.25 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，吐溫-80 1 mL/L，pH值調(diào)整到6.2，115 ℃濕熱滅菌20 min。

生理鹽水：準確稱量1.8 g NaCl固體，溶解于200 mL去離子水。

5 mmol/L硫酸：準確量取0.244 mL濃硫酸，加入1 L去離子水，混勻后通過0.45 μm水膜過濾。

1.2 儀器與設(shè)備

擠壓式榨汁機 荷蘭飛利浦單子有限公司；UV2800紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；Centrifuge 5430R離心機 德國艾本德有限公司；2XJD-A1270型培養(yǎng)箱 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；1200高效液相色譜儀、GC7890/MS5975氣相色譜-質(zhì)譜儀美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生長曲線測定[16]

將活化好的10 株實驗乳酸菌株按2%接種量分別接入滅菌的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，從0 h開始每隔2 h取樣，以未接種的MRS液體培養(yǎng)基作為空白對照，測定樣品在600 nm波長處的OD值，每個樣品重復(fù)測定3 次，根據(jù)時間和OD600nm值繪制各菌株的生長曲線。

1.3.2 耐受性實驗

將活化好的10 株實驗乳酸菌株按2%接種量分別接種于正常的和不同糖度（15、20 °Bx和25 °Bx）、不同pH值（pH 3.0、pH 3.5和pH 4.0）或不同乳酸質(zhì)量濃度（4、6、8 g/L和10 g/L）的MRS液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)24～36 h后取樣，觀察菌株生長情況，以未接種的不同糖度、不同pH值或不同乳酸含量的MRS液體培養(yǎng)基作為空白對照，測定樣品在600 nm波長處的OD值，每個樣品重復(fù)測定3 次。將接入正常MRS液體培養(yǎng)基中各菌株的OD600nm值作為標準，比較各菌株在不同條件下的OD600nm值，優(yōu)選出耐受性較好的菌株[17-18]。

1.3.3 梨汁發(fā)酵實驗

將購買的新鮮水晶梨經(jīng)鹽水浸泡后清洗，并于無菌條件下進行榨汁，加入冰片糖調(diào)節(jié)梨汁糖度為20 °Bx后分裝于無菌錐形瓶中密封，經(jīng)巴氏滅菌后4 ℃冷藏[19]。取活化后的乳酸菌液（GG8和ZG2菌濃度分別為4.36×108CFU/mL和5.12×108CFU/mL），6 000 r/min離心10 min，棄上清液，生理鹽水重復(fù)清洗2 次。按照10%的比例將2 株乳酸菌分別接種于梨汁中，30 ℃條件下發(fā)酵144 h，每24 h取樣待測[20]。

1.3.4 活菌數(shù)、pH值的測定

乳酸菌計數(shù)采用平板稀釋法[21]。pH值用pH計直接測定。

1.3.5 有機酸的測定

采用紫外高效液相色譜法測定有機酸含量，色譜柱為Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm）；流動相為5 mmol/L H2SO4溶液；流速0.6 mL/min；柱溫60 ℃；紫外檢測器；波長210 nm；進樣量20 μL。每個待測樣品重復(fù)3 次[22]。

1.3.6 揮發(fā)性成分測定

采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜方法測定與分析樣液中揮發(fā)性物質(zhì)。取8 mL發(fā)酵液樣品置于20 mL頂空瓶中，加入3 g NaCl，60 ℃水浴加熱，平衡10 min，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭靜態(tài)吸附50 min，熱解吸5 min。氣相色譜分離條件為：色譜柱HP-5；載氣He；流量1.0 mL/min；分流進樣，分流比20∶1；升溫程序：初始45 ℃（保留2 min），3.5 ℃/min升至220 ℃（保留2 min）。質(zhì)譜檢測條件：電子電離源，離子源溫度230 ℃，電壓 70 eV，發(fā)射電流34.6 μA；界面溫度280 ℃；掃描質(zhì)量范圍30～550 u。每個待測樣品重復(fù)3 次[13,23]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

生長曲線及活菌數(shù)、pH值的結(jié)果使用Origin Pro 8.0進行處理與分析。有機酸測定結(jié)果依據(jù)已有標樣的出峰時間和標準曲線進行處理與分析。揮發(fā)性成分利用質(zhì)譜全離子掃描圖譜和NIST05標準譜庫比對結(jié)果進行定性分析，采用氣相色譜峰面積歸一化法確定各組分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的生長曲線

圖1 不同乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of different strains of lactic acid bacteria

如圖1所示，菌株ZG1、ZG2、GG2生長速度較快，延滯期不明顯，很快進入對數(shù)期，并在發(fā)酵10 h后進入穩(wěn)定期；菌株GG8、BGG1、BGG2、WQ1和WQ2具有明顯的延滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期，在發(fā)酵2～4 h后進入對數(shù)期；菌株WS生長速度較慢，對數(shù)生長期短，且菌體數(shù)量較低；菌株NQ生長速度最慢，各生長期均不明顯，菌體數(shù)量無明顯變化。因此，菌株ZG1、ZG2、GG2、GG8、BGG1、BGG2、WQ1和WQ2生長性能良好，可對其耐受性能進一步研究。

2.2 乳酸菌耐受性篩選

梨汁發(fā)酵過程中，適當?shù)奶呛靠梢源龠M發(fā)酵的進行，改善發(fā)酵液的口感。其次，乳酸菌在發(fā)酵代謝過程中會產(chǎn)生乳酸及其他有機酸，乳酸作為主要代謝產(chǎn)物，在發(fā)酵初期含量會迅速增加，導(dǎo)致發(fā)酵液pH值迅速下降[17-18]，從而抑制乳酸菌生長。因此，較好的耐受特性有助于乳酸菌的發(fā)酵。根據(jù)菌株耐受性分析結(jié)果（表1）可知，10 株乳酸菌的生長情況在不同糖度、不同pH值和不同乳酸含量條件下會不同程度受到影響。菌株ZG1、ZG2、GG2、GG8、WQ2和NQ均具有相對較好的耐糖特性，滿足發(fā)酵要求；菌株ZG2、GG2和GG8在pH 3.0～4.0條件下生長良好或受抑制程度不明顯，說明具有較好的耐酸性；菌株GG8的耐乳酸特性最好，其次為菌株ZG2。綜合菌株的耐受性，選擇耐受性均較好的菌株GG8和菌株ZG2作為發(fā)酵菌株，對其發(fā)酵性能進一步研究[24-25]。

表1 不同乳酸菌的耐受性分析Table1 Tolerance of lactic acid bacterial stains to stress conditions

2.3 發(fā)酵液中活菌數(shù)與pH值變化

將通過篩選得到的干酪乳桿菌GG8和植物乳桿菌ZG2作為發(fā)酵菌株，接入梨汁中發(fā)酵，對發(fā)酵液中活菌數(shù)測定，結(jié)果見圖2。干酪乳桿菌GG8在發(fā)酵24 h時活菌數(shù)增加，且在120 h內(nèi)活菌數(shù)始終在106CFU/mL以上，之后活菌數(shù)迅速下降；植物乳桿菌ZG2在發(fā)酵液中活性相對較弱，發(fā)酵24 h時活菌數(shù)增加，之后開始明顯下降，至發(fā)酵結(jié)束時降到105CFU/mL以下。發(fā)酵液中pH值降低不僅能夠影響一些不耐酸的微生物生長繁殖，同時也賦予了柔和的酸味[26]。如圖3所示，2 株菌在發(fā)酵過程中pH值的下降趨勢相似，發(fā)酵前期pH值迅速下降，這與發(fā)酵前期乳酸菌的大量增殖有關(guān)；發(fā)酵后期，由于代謝產(chǎn)物、pH值等因素抑制，乳酸菌進入衰亡期，活菌數(shù)下降，pH值趨于穩(wěn)定[27]。相較植物乳桿菌ZG2，干酪乳桿菌GG8在梨汁發(fā)酵液中生長情況較好，受條件抑制影響較小。

圖2 2 株乳酸菌純種發(fā)酵梨汁中活菌數(shù)變化Fig.2 Changes in viable count in pear juice fermented by 2 strains of lactic acid bacteria

圖3 2 株乳酸菌純種發(fā)酵梨汁的pH值變化Fig.3 Changes in pH value in pear juice fermented by 2 strains of lactic acid bacteria

2.4 發(fā)酵液中有機酸含量變化

有機酸可以幫助人體完成新陳代謝的過程，修復(fù)人體病變器官等[22,28]。由圖4可知，梨汁原液中主要含有甲酸和蘋果酸，以及微量琥珀酸。2 株乳酸菌發(fā)酵144 h后，發(fā)酵液中有機酸種類相似，干酪乳桿菌GG8發(fā)酵液總酸含量高于植物乳桿菌ZG2。經(jīng)干酪乳桿菌GG8發(fā)酵24 h，甲酸、蘋果酸及琥珀酸等均迅速減少，乳酸和檸檬酸增加明顯，乙酸少量增加；經(jīng)植物乳桿菌ZG2發(fā)酵24 h，甲酸、蘋果酸及琥珀酸等也迅速減少，乳酸含量增加，且高于干酪乳桿菌GG8發(fā)酵液，乙酸和檸檬酸含量僅少量增加。因此，植物乳桿菌ZG2產(chǎn)乳酸的能力明顯高于干酪乳桿菌GG8，產(chǎn)檸檬酸能力弱于干酪乳桿菌GG8。

圖4 干酪乳桿菌GG8（A）和植物乳桿菌ZG2（B）產(chǎn)有機酸情況Fig.4 Organic acid production rates of L. casei GG8 (A) and L. plantarum ZG2 (B)

2.5 發(fā)酵液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

發(fā)酵梨汁的風(fēng)味物質(zhì)主要來源于原料本身和乳酸菌發(fā)酵后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[29]。根據(jù)表2可知，發(fā)酵前后共檢測到26 種揮發(fā)性成分，其中醇類最多，為9 種，醛酮類6 種，酯類和酸類分別為3、2 種。發(fā)酵前后，構(gòu)成梨汁主體風(fēng)味的物質(zhì)主要包括2-甲氧基-3-甲基吡嗪、芳樟醇和松油醇。

梨汁原液中主體風(fēng)味物質(zhì)有正己醇、2-甲氧基-3-甲基吡嗪、芳樟醇、松油醇、正辛酸、3,5-二甲基苯甲醛、大馬士酮和香葉基丙酮等。干酪乳桿菌GG8發(fā)酵72 h后，共檢測到15種揮發(fā)性成分，其中構(gòu)成主體風(fēng)味的有正己醇、2-甲氧基-3-甲基吡嗪、芳樟醇、松油醇、正辛酸、3,5-二甲基苯甲醛、橙花醇、大馬士酮，以及通過發(fā)酵新產(chǎn)生的己酸乙酯和癸酸乙酯，賦予發(fā)酵液特殊的酒香；至發(fā)酵144 h時，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)部分消失，保留了2-甲氧基-3-甲基吡嗪、芳樟醇、松油醇和3,5-二甲基苯甲醛4種主要成分的同時，新生成了L-（－）-二苯甲酰酒石酸、反式-2,4-癸二烯醛、合金歡醇和棕櫚酸乙酯，這使得發(fā)酵后期梨汁風(fēng)味更加復(fù)雜、獨特。植物乳桿菌ZG2發(fā)酵72 h，共檢測到17種揮發(fā)性成分，主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)同梨汁原液類似，主要包括正己醇、2-甲氧基-3-甲基吡嗪、芳樟醇、松油醇、正辛酸、3,5-二甲基苯甲醛和香葉基丙酮等，發(fā)酵新形成了具有特色風(fēng)味的己醛、苯乙醇和反式-2,4-癸二烯醛；發(fā)酵144 h時，大量揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)消失，保留了3種主要的風(fēng)味物質(zhì)[30-31]。較植物乳桿菌ZG2發(fā)酵梨汁，干酪乳桿菌GG8發(fā)酵梨汁含有相對豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，風(fēng)味獨特。

表2 2 種乳酸菌發(fā)酵梨汁中、后期的主要揮發(fā)性物質(zhì)相對含量比較Table2 Relative contents of volatile substances in pear juice fermented with lactic acid bacteria during the middle and late stages of fermentation

3 結(jié) 論

通過研究10 株分離于水果發(fā)酵液及其他不同來源乳酸菌的耐糖、酸及耐乳酸等特性，篩選出2 株適宜梨汁發(fā)酵的乳酸菌，分別為干酪乳桿菌GG8和植物乳桿菌ZG2。通過對2 株菌的生長情況、發(fā)酵特性及代謝產(chǎn)物研究后發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌GG8起酵快，發(fā)酵時間長，不易受環(huán)境抑制影響，產(chǎn)酸多，且能夠產(chǎn)生較為豐富的揮發(fā)性物質(zhì)；植物乳桿菌ZG2產(chǎn)乳酸能力強。綜合考慮菌株的各項性能，選擇干酪乳桿菌GG8作為梨汁發(fā)酵的優(yōu)選菌株具有很大潛力和價值，可對其性能及在梨汁發(fā)酵工藝中的應(yīng)用進一步研究驗證。