基于轉錄組研究MPEF 對畢赤酵母的致死機理

朱 寧，于 寧，朱 月，韋玉龍，張嘉穎，孫愛東*

（北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京 100083）

畢赤酵母是引起酸性果汁腐敗變質的主要微生物之一[1]，對果汁產(chǎn)業(yè)的發(fā)展極為不利。高壓脈沖電場（pulsed electric field，PEF）技術作為一種新型非熱加工技術，在保證食品安全的同時，能最大程度地保持其原有的色、香、味及營養(yǎng)品質[2-3]。PEF是通過高電壓獲得高場強，高壓脈沖發(fā)生器成本較高，長期使用易產(chǎn)生氧化性物質等[4]，這些問題限制了PEF在實際生產(chǎn)中的應用，因此，實現(xiàn)低電壓下的脈沖電場殺菌成為當前PEF研究領域的熱點。

隨著微機電技術的成熟和發(fā)展，生物芯片和微芯片在脈沖電場領域的應用得到了廣泛關注。目前，基于微芯片的脈沖電場技術（microchip pulsed electric field，MPEF）已被應用于細胞融合、細胞捕獲[5]、裂解和電轉染[6]等生物學領域。因為微芯片具有微米級的電極間距，較傳統(tǒng)PEF處理室的間距減少幾十倍至上百倍，達到相同的殺菌效果所需電壓大幅降低[7]；微芯片的高表面體積比有利于散熱。因此，借助微芯片研究脈沖電場殺菌有十分理想的發(fā)展空間。近年來，已有研究者將目光投入到MPEF殺菌技術研究中[8]，但仍處于初期平臺優(yōu)化階段，在前人研究基礎上，本課題組研發(fā)了一種新型MPEF技術，實現(xiàn)低電壓下對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和釀酒酵母較好的殺滅效果[9]。

細胞膜不可逆破損和細胞內(nèi)化合物的泄漏是PEF導致微生物死亡的關鍵因素[10-11]，此外，脈沖電場引起細胞膜成分的變化也被廣泛關注[12-13]。但是，目前關于PEF的致死機理尚沒有統(tǒng)一定論，微生物整體基因調控的研究較少。MPEF技術由于微芯片的加入極大地降低了殺菌電壓，盡管同屬于脈沖電場殺菌，但微處理室是否對微生物有不同的影響仍有待驗證。為更好地利用MPEF技術，充分了解其殺菌機理是十分必要的。轉錄組測序（RNA-Seq）根據(jù)基因組的測序信息和注釋情況，從整個轉錄水平上反映細胞中基因表達情況及其調控機制，可用來研究特定生物過程中基因表達的差異[14]。借助該技術，前人已經(jīng)成功闡明小檗堿對禽源大腸桿菌的抑菌作用[15]、黃芩水煎劑對尿道致病性大腸埃希氏菌的作用機理[16]、釀酒酵母乙酸耐性的分子機制[17]等，但在脈沖電場殺菌方面類似研究較少。

本研究分析MPEF技術對畢赤酵母的致死效果和處理前后基因表達的變化，結合生物信息學方法對差異表達基因進行注釋、分類和相關功能分析，探究該技術的殺菌機理，為MPEF技術應用于果汁殺菌提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

畢赤酵母（Pichia）為本實驗室從藍莓汁中分離純化的1 株腐敗菌。

YPD肉湯培養(yǎng)基、YPD瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒、DNase I、TIANScript cDNA試劑盒、Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒 天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-30KBS蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；TS-100B恒溫搖床 上海捷呈實驗儀器有限公司；3H16RI冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；HiSeq2000測序平臺 美國Illumina公司；ABI 7500 Fast實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence quantification-polymerase chain reaction，q-PCR）儀美國應用生物系統(tǒng)公司；方波脈沖電源 上海索宜電子科技有限公司。

實驗室規(guī)模的連續(xù)MPEF處理系統(tǒng)主要由定制的方波脈沖電源和自行設計的微芯片（圖1）組成[9]。脈沖寬度設定為0.20 ms，每次處理前后，用75%乙醇溶液清洗通道，然后用無菌水沖洗。

圖1 微芯片示意圖Fig. 1 Schematic of the microchip

1.3 方法

1.3.1 畢赤酵母的培養(yǎng)

YPD肉湯和瓊脂培養(yǎng)基于121 ℃滅菌20 min，將從腐敗藍莓汁中分離出的畢赤酵母菌株接種到50 mL無菌YPD肉湯培養(yǎng)基中，32 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)12 h至對數(shù)中后期，重復活化2 代待用，菌液濃度為106～107CFU/mL。對數(shù)中后期細胞分裂迅速、生長旺盛，因此該時期細胞對電場的變化更為敏感[9]，選擇培養(yǎng)至對數(shù)中后期的畢赤酵母細胞進行后續(xù)研究更具代表性。

1.3.2 致死和亞致死損傷的測定

通過平板計數(shù)法檢測MPEF處理后畢赤酵母死亡和亞致死情況。非選擇性培養(yǎng)基為YPD瓊脂培養(yǎng)基，向該培養(yǎng)基中添加4.5% NaCl溶液作為選擇性培養(yǎng)基[18]。通過比較不同電壓（100～500 V）和脈沖個數(shù)（20～100）下細胞的對數(shù)下降值，研究MPEF技術對畢赤酵母的鈍化效果。對數(shù)下降值（lgS）[19]計算見式（1）：

式中：N0為處理前非選擇性或選擇性培養(yǎng)基中存活的微生物數(shù)/（CFU/mL）；N1為處理后在相同培養(yǎng)基中存活的微生物數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.3 畢赤酵母總RNA的提取和測序

提取樣品總RNA并使用DNase I消化DNA后，用Oligo d（T）磁珠純化總RNA中的mRNA，向得到的mRNA中加入適量打斷試劑高溫條件下使其片段化，再以片段后的RNA為模板，合成cDNA，經(jīng)過磁珠純化、末端修復、3’末端加堿基A、加測序接頭后，進行PCR擴增，從而完成整個文庫制備工作，文庫質控合格后進行測序、分析。

1.3.4 q-PCR驗證

選擇6 個顯著表達的差異基因進行q-PCR分析，引物序列見表1，根據(jù)TIANScript cDNA試劑盒說明合成cDNA第1鏈，采用Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒，ABI 7500 FAST q-PCR系統(tǒng)進行實時熒光定量檢測，所有實驗重復3 次。

表1 q-PCR引物Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 基因定量

借助RSEM工具進行基因表達定量，通過Paired-end關系、reads長度、質量值等，基于最大期望算法建立最大似然的豐富度模型，結果以Fragment PerKilo Million（FPKM）表示，計算見式（2）：

式中：FPKM為基因A表達量；C為比對到基因A的reads數(shù)；L為fragment長度；N為比對到參考基因的總reads數(shù)。

1.4.2 差異表達基因

采用edgeR軟件包進行差異表達基因的分析，當基因表達量在不同樣品間具有差異且統(tǒng)計分析中假陽性率小于0.05，同時差異倍數(shù)在2 倍以上時，認為其在2 個不同樣品中具有顯著差異表達。

1.4.3 差異基因深入挖掘

把所有差異表達基因在基因本體（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫中進行各個term映射，計算每個term基因數(shù)目，然后應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著富集的GO條目，以校正后的P不大于0.05為閾值。通過GO功能顯著性富集分析可確定差異表達基因行使的主要生物學功能。京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）[20]是有關Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫，通過Pathway顯著性富集能確定差異表達基因參與的主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。

1.4.4 q-PCR結果計算

根據(jù)q-PCR原始檢測結果，按照2－ΔΔCt法計算各樣品目的基因相對定量結果，見式（3）：

式中：F為目的基因的相對表達量。

上述所有實驗重復3 次，借助Origin 9.0軟件對致死和亞致死損傷結果進行作圖，采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 MPEF對畢赤酵母的致死與亞致死效果

圖2 電壓（a）和脈沖個數(shù)（b）對畢赤酵母鈍化效果的影響Fig. 2 Logarithmic decline of P. rhodanensis with respect to voltage (a)and pulse number (b)

由圖2可知，畢赤酵母在選擇性培養(yǎng)基中對數(shù)下降值更高，特別是在200 V電壓、80 個脈沖條件下，畢赤酵母在選擇性培養(yǎng)基中下降了（3.56±0.09）個對數(shù)值，而在非選擇性培養(yǎng)基中僅下降了（2.81±0.11）個對數(shù)值，兩者的差值證明了亞致死細胞的存在[21]。Wang Mansheng等[22]研究PEF技術對釀酒酵母的影響，結果表明PEF處理可以導致細胞死亡、亞致死或者無明顯損傷。如圖2a所示，隨著電壓的增加，MPEF對微生物的致死效果顯著增強（P＜0.05），這與Zhao Wei等[23]的研究結果一致。當電壓達到400 V時，畢赤酵母在2 種培養(yǎng)基中的對數(shù)下降值無明顯差異，說明400 V電壓對畢赤酵母有很好的致死效果。此外，畢赤酵母的致死效果隨著脈沖個數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，如圖2b所示，當脈沖個數(shù)為80時，亞致死細胞數(shù)接近0，此后，持續(xù)增加脈沖個數(shù)，致死效果沒有顯著變化。因此，MPEF在400 V電壓、80 個脈沖條件下，可以很好地殺滅畢赤酵母。

2.2 畢赤酵母差異表達基因的一般分析

通過對MPEF處理前后畢赤酵母轉錄組測序的數(shù)據(jù)進行標準化處理，對所有基因的表達量繪制散點圖，結果如圖3所示，縱坐標為差異顯著性，橫坐標為在不同條件下基因表達變化倍數(shù)，灰色為差異變化不顯著基因，共計16 610 個，紅色和藍色為差異變化顯著基因，共計794 個，其中上調基因361 個，下調基因433 個。對差異基因的表達量進行l(wèi)og2處理，然后根據(jù)處理后的表達量進行樣品間的聚類分析（圖4）。

圖4 差異基因的聚類圖Fig. 4 Cluster diagram of differentially expressed genes

由表2可知，差異基因的GO功能富集主要集中在細胞成分（6 706 條）、分子功能（4 854 條）和生物過程（15 860 條）3 個方面。參與三羧酸循環(huán)和小亞甲基RNA、丙酮酸轉運、核仁、大亞基前體、膜的完整性、異檸檬酸脫氫酶活性、ATP酶活性、跨膜轉運蛋白活性、核酸酶活性等多種功能的基因進行極顯著差異表達。對MPEF處理前后畢赤酵母差異表達基因進行KEGG顯著性富集分析（表2），由于電場對微生物的作用，導致三羧酸循環(huán)、代謝和生物合成等發(fā)生顯著性變化。

表2 顯著富集的9 條代謝通路Table 2 9 Metabolic pathways significantly enriching differentially expressed genes

2.3 q-PCR驗證實驗結果

根據(jù)上述GO和KEEG富集分析，選取各條目和代謝通路中顯著變化，且表達量較多的6 個差異基因，它們主要參與糖代謝、RNA代謝和氨基酸代謝，利用q-PCR對MPEF處理前后的基因差異表達倍數(shù)（MPEF組/對照組）進行分析，結果如表3所示，雖然轉錄組測序結果和q-PCR分析結果表達倍數(shù)有差異，但差異表達的變化趨勢基本一致，說明轉錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性，表達倍數(shù)的差異可能是由于儀器、算法等不同造成的。

表3 差異表達基因q-PCR驗證結果Table 3 q-PCR Validation of differentially expressed genes

2.4 基于轉錄組數(shù)據(jù)的MPEF致死畢赤酵母機制分析

2.4.1 MPEF對參與細胞結構基因表達的影響

如表4所示，通過分析MPEF處理前后畢赤酵母的基因差異表達，發(fā)現(xiàn)參與生物膜的形成和成分等基因出現(xiàn)顯著差異?？刂粕锬ば纬傻幕蝻@著下調，說明膜的完整性遭到破壞[24]。MPEF處理組中編碼質膜成分的基因中出現(xiàn)2 個顯著上調，8 個顯著下調；編碼內(nèi)質網(wǎng)膜成分的基因中出現(xiàn)了2 個顯著下調。生物膜成分的改變可能造成膜流動性和通透性的變化[25]，Liu Zhiwei等[26]的研究結果表明PEF處理引起大腸桿菌細胞膜成分的改變，進而對膜的流動性造成影響，導致細胞死亡。Ferrario等[27]利用流式細胞儀結合PI染色技術驗證了PEF對微生物的致死效果與細胞膜的損傷有關。此外，調節(jié)細胞壁形成及功能等基因出現(xiàn)顯著變化，說明MPEF處理對細胞壁產(chǎn)生了影響；由MPEF處理后畢赤酵母細胞中內(nèi)質網(wǎng)合成與功能的下降，推測糖類、脂質的合成及蛋白質的運輸受到了影響[28]；MPEF處理后，細胞器裂變加劇，與內(nèi)質網(wǎng)、線粒體等形成和功能有關的基因均發(fā)生顯著變化，2 個調控細胞骨架的差異基因顯著下調。因此，MPEF處理導致細胞膜等生物膜受損，細胞壁、細胞器等形成和功能發(fā)生變化，細胞成分改變，上述變化是MPEF致死細胞的主要原因之一。

表4 部分與細胞結構相關的差異基因轉錄水平Table 4 Transcription levels of differentially expression genes related to cell structure

2.4.2 MPEF對參與DNA、RNA和蛋白質合成代謝基因表達的影響

由表5可知，與對照組相比，MPEF組中核苷酸的合成、調節(jié)均顯著下調，與核糖核苷結合相關基因出現(xiàn)顯著變化，DNA復制和代謝相關基因均不同程度地下調，推測DNA的復制減緩或部分被抑制；DNA損傷上調，且重組修復、雙鏈斷裂修復等均顯著下調，DNA修復出現(xiàn)1 個上調基因，4 個下調基因，說明電場造成DNA損傷，破壞其自身修復能力。與核仁相關基因、控制核糖體生物合成的基因顯著下調，控制rRNA、mRNA、tRNA的生物過程、結合過程和代謝過程的基因均不同程度地下調；大亞基和小亞基的生物合成顯著下調；RNA和蛋白質代謝紊亂；調節(jié)蛋白質定位至細胞核和細胞器，控制基因表達和蛋白質翻譯、修飾、運輸?shù)然蝻@著下調。上述變化表明MPEF處理造成畢赤酵母基因損傷[29]，同時對RNA和蛋白質的生物合成和代謝造成顯著影響，核苷酸水平的降低，蛋白質合成[30]和功能受限[31]是電場造成畢赤酵母死亡的原因之一。

表5 部分與DNA、RNA和蛋白質合成代謝相關的差異基因轉錄水平Table 5 Transcription levels of differentially expressed genes related to synthesis and metabolism of DNA, RNA and protein

2.4.3 MPEF處理對酶活性相關基因表達的影響

表6 部分與酶活性相關的差異基因轉錄水平Table 6 Transcription levels of differentially expressed gene related to enzymatic activities

通過比較對照組和MPEF組酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)MPEF處理對畢赤酵母體內(nèi)酶活性產(chǎn)生顯著影響，部分酶活性相關的基因轉錄水平變化如表6所示。MPEF處理導致半胱天冬蛋白酶被激活，該酶可以直接破壞細胞結構，調節(jié)蛋白喪失功能，比如阻斷DNA復制、造成DNA和核結構的損傷、拆散細胞骨架[32]等，這與2.4.2節(jié)結果一致。蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性調節(jié)的下降意味著蛋白質功能受損[33]，核糖核酸酶、RNA聚合酶活性均下調；此外，輔酶、ATP合成酶、丙酮酸脫羧酶等參與細胞代謝的酶均出現(xiàn)顯著變化，說明相應代謝反應也受到了影響；控制氧化還原酶活性的基因出現(xiàn)1 個顯著上調，3 個顯著下調；酶的催化活性也受到顯著影響。因此，MPEF處理對酶產(chǎn)生顯著影響，酶活性的變化直接或間接影響了生物大分子的功能、代謝反應的發(fā)生[34]等，說明相應細胞進程改變，這也是引起細胞死亡的原因。

2.4.4 MPEF處理對生物合成相關基因表達的影響

表7 部分與生物合成相關的差異基因轉錄水平Table 7 Transcription levels of differentially expressed genes related to biosynthesis

從表7可以看出，MPEF處理破壞正常的生物合成調控和細胞體內(nèi)平衡。谷氨酸生物合成的變化表明蛋白代謝受到影響[35]，控制肌動蛋白絲、核黃素、ATP、脂質、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸合成的基因顯著下調，肌動蛋白絲在細胞體內(nèi)具有支撐和信息傳導作用[36]，MPEF處理使其合成受阻，導致細胞結構受損；MPEF組中的血紅素、脂蛋白以及卵磷脂等生物合成也發(fā)生了顯著變化。此外，核堿基的生物合成中出現(xiàn)1 個顯著上調基因，3 個顯著下調基因，說明堿基配對出現(xiàn)異常，可能引起蛋白翻譯錯誤[37]，影響畢赤酵母的正常生長。MPEF處理對細胞體內(nèi)大分子物質的生物合成有一定的影響，破壞體內(nèi)平衡過程，這也是引起細胞死亡的原因。

2.4.5 MPEF處理對跨膜運輸能力基因表達的影響

由表8可知，離子跨膜轉運蛋白活性受電場影響較大，而控制ATP偶聯(lián)離子跨膜轉運蛋白活性的4 個基因中有3 個顯著下調，導致離子跨膜運輸能力發(fā)生變化。鈉離子跨膜轉運蛋白活性的下調說明MPEF影響鈉離子的正常轉運；銅離子作為胞內(nèi)酶所必需的組分，其轉運能力的下降對細胞正常生命活動有顯著影響[38]。此外，MPEF處理對氨基酸、多胺、有機酸、丙酮酸、糖等的轉運具有顯著影響，這些有機化合物跨膜轉運能力的變化說明酵母細胞體內(nèi)代謝反應、生命活動發(fā)生改變，電場顯著抑制了核酸的運輸和跨膜運輸調節(jié)，使畢赤酵母體內(nèi)跨膜信號轉導紊亂，進一步影響細胞的正常生理功能，導致酵母細胞死亡。

表8 部分與運輸能力相關的差異基因轉錄水平Table 8 Transcription levels of differentially expressed genes related to transport capacity

2.4.6 MPEF處理對代謝過程相關基因表達的影響

表9 部分與代謝過程相關的差異基因轉錄水平Table 9 Transcription levels of differentially expressed genes related to metabolic processes

如表9所示，MPEF作用于畢赤酵母，細胞碳水化合物代謝過程出現(xiàn)29 個上調基因，12 個下調基因；電場對氨基酸的代謝也有顯著影響，谷氨酸合成代謝出現(xiàn)2 個顯著上調基因，4 個顯著下調基因。此外，MPEF處理對細胞內(nèi)脂質、有機酸、核苷酸、核黃素、芳香化合物、維生素等代謝均有顯著影響，說明MPEF處理不僅影響生命活動所必需的初級代謝過程，對次級代謝過程也有一定影響。電場作用于酵母細胞后，調節(jié)其碳水化合物代謝、糖酵解等過程的差異基因顯著變化，控制ATP代謝過程的2 個差異基因全部顯著下調。代謝調節(jié)水平的下降與酶量和酶活性的降低緊密聯(lián)系[39]，上述結果也說明了MPEF處理影響mRNA和蛋白的翻譯以及酶活性。代謝調節(jié)的減弱增加了細胞新陳代謝活動的能耗[40]。

分解代謝是釋放能量的過程，MPEF組與對照組相比，控制碳水化合物分解過程的差異基因中10 個顯著上調，5 個顯著下調；參與乙醛酸分解代謝、核苷酸分解代謝的差異基因全部下調，參與芳香化合物和氮化合物分解代謝過程的差異基因中分別有4 個顯著上調，8 個顯著下調；參與三羧酸循環(huán)的所有差異基因全部顯著上調，說明MPEF處理對畢赤酵母細胞的分解代謝能力有顯著影響，對部分分解代謝有抑制作用，對部分分解代謝有激活作用，激活可能是細胞為了抵御電場不利影響而出現(xiàn)的應激反應。因此，MPEF處理使得畢赤酵母細胞內(nèi)代謝機制紊亂[41]，破壞其自動調節(jié)能力，無法適應電場環(huán)境，最終導致細胞死亡。

3 結 論

MPEF技術對畢赤酵母有很好的致死效果，在400 V電壓、80 個脈沖條件下，畢赤酵母下降了（6.39±0.17）個對數(shù)值。MPEF處理對細胞的損傷較為嚴重，包括細胞膜在內(nèi)的生物膜是其作用的一個關鍵位點，膜完整性遭到破壞；細胞壁的保護作用減弱；細胞器和細胞骨架受損。細胞組分的改變導致相應功能的變化，最為明顯的是核仁、核糖體的生物合成和功能被顯著抑制，這是引起細胞死亡的主要原因。此外，MPEF處理造成基因損傷、堿基配對異常、蛋白質轉錄翻譯受阻；蛋白功能被部分抑制，酶活性、生物合成及跨膜轉運能力發(fā)生改變，最終造成畢赤酵母體內(nèi)代謝紊亂；自由基增多，而抗氧化酶系下調表達導致自由基清除系統(tǒng)被減弱，最終引起畢赤酵母死亡。電場對線粒體產(chǎn)生十分顯著的影響，線粒體受損可能導致細胞色素C的釋放，同時半胱天冬蛋白酶顯著上調，形成酵母細胞凋亡小體，從而誘導畢赤酵母凋亡的發(fā)生，該過程是MPEF導致基因調控變化引起的。

MPEF處理使得控制畢赤酵母細胞生長發(fā)育、繁殖、呼吸和信號轉導的基因發(fā)生顯著變化，多生物過程調控、細胞內(nèi)分子定位及調節(jié)等顯著下降。MPEF對微生物的鈍化機制是十分復雜的，基因損傷和調控的變化，細胞結構的破壞，酶活性的改變是減弱生物合成能力和引發(fā)代謝紊亂的前提，是導致細胞死亡的主要原因。