劉毓，劉斌，傾麗梅，劉翠萍，徐麗媛，楊永秀

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，可發(fā)生于任何年齡，早期幾乎無癥狀，缺乏有效的診斷方法，大多就診時已為晚期，而目前晚期卵巢癌并無有效的治療手段。美國癌癥協(xié)會最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，每年約2萬卵巢癌新發(fā)病例，占女性惡性腫瘤的5%，約62%的病例死亡[1]，致死率居婦科腫瘤首位，因此早期診斷、疾病監(jiān)測及個體化治療對卵巢癌的預(yù)后具有重要意義。目前，用于卵巢癌檢測的血清腫瘤標(biāo)志物如糖類抗原 125（CA125）、人附睪蛋白 4（HE4）等因敏感度和特異度低而限制了臨床應(yīng)用，所以，需要尋找更準(zhǔn)確的生物學(xué)指標(biāo)。

1 循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）

循環(huán)游離 DNA（circulating free DNA，cfDNA）是循環(huán)體液中游離于細(xì)胞外的機(jī)體內(nèi)源性DNA。凋亡、壞死或活躍細(xì)胞被巨噬細(xì)胞等吞噬消化后，釋放出游離于血液的DNA，即cfDNA。其中一部分cfDNA來源于腫瘤細(xì)胞，釋放腫瘤基因組DNA，稱為ctDNA[2]。ctDNA是循環(huán)過程中脫落的微小cfDNA亞群，攜帶腫瘤的全部表觀遺傳特征，包含原發(fā)腫瘤DNA，也包含轉(zhuǎn)移腫瘤DNA[3]，且其半衰期較短，能及時反映機(jī)體腫瘤情況。近年來，ctDNA在卵巢癌中的研究越來越多，已經(jīng)成為卵巢癌診斷和治療的研究熱點。卵巢癌具有瘤內(nèi)異質(zhì)性和組織多樣性，其ctDNA存在多種類型的DNA改變，包括異常突變、高甲基化、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）、雜合性缺失（LOH）等，ctDNA的這些改變與原發(fā)腫瘤病灶基因改變相同，利用這一特點，我們可以通過ctDNA為卵巢癌患者管理提供無創(chuàng)和敏感的技術(shù)方法，在卵巢癌的診斷、耐藥性監(jiān)測和預(yù)后評價中具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 ctDNA檢測方法

晚期卵巢癌患者的ctDNA信息容易獲得，在血漿和腹水中的檢出率達(dá)100%[4]，但早期患者ctDNA濃度較低，常呈高度碎片化狀態(tài)[5]，檢測困難限制了其臨床應(yīng)用。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，ctDNA的檢測準(zhǔn)確性有所提升。目前檢測技術(shù)主要有富集聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、數(shù)字 PCR（dPCR）和下一代測序（nextgeneration sequencing，NGS）技術(shù)[6]，3 種方法各有優(yōu)點和局限性。富集PCR使用方便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但由于野生DNA擴(kuò)增而限制其分析的敏感度，通常無法檢測極低水平的ctDNA；dPCR應(yīng)用廣泛，有較高的敏感度和特異度，但需根據(jù)已知突變設(shè)計特定引物或探針，只局限于單個已知突變熱點的研究；NGS技術(shù)可以快速、高效地檢測體液中的基因突變，簡便、創(chuàng)傷小、敏感度和特異度均較高，但擴(kuò)增過程仍有可能引入錯誤基因的插入。除此之外，要實現(xiàn)ctDNA的臨床應(yīng)用，還需在樣本采集、儲存和檢測方面做進(jìn)一步規(guī)范。

NSG是一種新型高通量測序技術(shù)，促進(jìn)了液體活檢（liquid biopsy，LB）在實體腫瘤和無組織腫瘤中的快速應(yīng)用[7]，為惡性腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療提供了一個質(zhì)的飛躍。Sato等[8]研究為減少NGS技術(shù)錯誤，提出基于NGS的分子條形碼技術(shù)，在擴(kuò)增前將分子條形碼標(biāo)記到ctDNA上，驗證單個分子與原始序列的一致性，提高ctDNA的準(zhǔn)確度和檢測極限。有研究人員創(chuàng)造了基于Cas13的分子檢測平臺，即特異性高敏感度酶報告解鎖（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking，SHERLOCK），在極低濃度下仍能檢測核苷酸[9]。另一種基于CRISPR的方法稱為DNA內(nèi)切酶靶向的CRISPR反式報告檢測系統(tǒng)（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter，DETECTR）[6]，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對野生PIK3CA基因的ctDNA片段進(jìn)行剪切，并結(jié)合Cas12a作為敏感檢測器，形成熒光報告基因，提高突變基因的檢測敏感度[10]。由于克隆性造血（clonal hematopoiesis，CH，指造血干細(xì)胞維持自我更新的造血增殖行為）的存在可能使ctDNA檢測產(chǎn)生假陽性結(jié)果，外周血細(xì)胞配對基因分型可以避免將CH衍生突變誤診為隱匿性惡性腫瘤，減少假陽性[11]。這些新型方法為ctDNA精準(zhǔn)檢測提供了新思路，可能比現(xiàn)有技術(shù)更快速、敏感，但要實現(xiàn)臨床應(yīng)用還需進(jìn)一步研究。

3 ctDNA在卵巢癌診療中的應(yīng)用

3.1 早期診斷與篩查卵巢深居盆腔，且為生殖器官，卵巢癌早期幾乎無癥狀，大多就診時已為晚期。早期5年存活率達(dá)90%，晚期5年存活率為27%[1]，所以早期診斷卵巢癌對患者的預(yù)后具有重要意義。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)腫瘤時ctDNA水平顯著升高，Gormally等[12]通過大型縱向前瞻性研究檢測1 500名健康者外周血ctDNA突變基因，有33例受試者突變陽性，對突變陽性者密切隨訪，其中16例在平均18.3個月后發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤，可見ctDNA突變可能是腫瘤發(fā)生的必要階段。ctDNA在卵巢癌的診斷中具有重要的臨床意義，在對1 005例腫瘤患者進(jìn)行ctDNA評估時，卵巢癌的診斷敏感度達(dá)98%，結(jié)合循環(huán)蛋白檢測后，卵巢癌的預(yù)測準(zhǔn)確率為79%，二次重復(fù)預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)92%[13]。對于卵巢癌這種隱匿性婦科惡性腫瘤，ctDNA的應(yīng)用前景較為廣闊。Shao等[14]研究選取36例卵巢癌患者以及41例卵巢良性腫瘤和健康人群，發(fā)現(xiàn)卵巢癌組血清cfDNA水平高于對照組（P＜0.01），良性腫瘤亞組與健康亞組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而且，國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）Ⅲ、Ⅳ期患者cfDNA水平明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P＜0.01）。可見，ctDNA能早期診斷腫瘤并反映腫瘤負(fù)荷，如果再結(jié)合特異腫瘤標(biāo)志物及影像學(xué)檢查，實現(xiàn)腫瘤定位，其有望成為卵巢癌篩查項目之一。

ctDNA不僅可以定量檢測，ctDNA突變基因檢測也能實現(xiàn)腫瘤早期診斷。Phallen等[15]在68%的早期卵巢癌組織中檢測出體細(xì)胞突變，與ctDNA突變高度一致[16]。有研究利用cfDNA完整性指數(shù)（即長cfDNA片段和短cfDNA片段的比值）進(jìn)行腫瘤危險因素評估和分層[17]。Zhang等[18]研究檢測48例卵巢癌、卵巢囊腫及健康女性血漿樣本ALU重復(fù)序列的完整性指數(shù)，卵巢癌組ALU長片段和完整性指數(shù)明顯高于對照組（P＜0.05）。ctDNA在侵襲性和轉(zhuǎn)移性強(qiáng)的腫瘤類型中濃度較高，如高級別漿液性卵巢癌（HGSC）、結(jié)直腸癌和前列腺癌等。為了證實ctDNA在局限性卵巢癌中是否有應(yīng)用價值，有研究檢測成人型卵巢顆粒細(xì)胞瘤（AGCTs）中的ctDNA特異性突變基因。AGCTs是一種低度惡性腫瘤，進(jìn)展緩慢，預(yù)后良好，但傾向于晚期復(fù)發(fā)，診斷時的期別是其重要的預(yù)后因素。F?rkkil?等[19]對33例AGCTs患者血漿FOXL2基因進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)36%的患者突變陽性，初步證明ctDNA可用于AGCTs的診斷。

綜上，通過ctDNA定量及特異性突變基因檢測可實現(xiàn)卵巢癌的早期診斷并監(jiān)測卵巢癌的發(fā)生，是一種快速、高效的非侵入性方法。除此之外，其還能克服取樣困難情況下的腫瘤檢測，作為卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物，成為LB的主要手段。

3.2 耐藥性監(jiān)測與指導(dǎo)用藥化療耐藥是當(dāng)前卵巢癌治療面臨的最主要問題之一。卵巢癌的主要治療方法是手術(shù)，聯(lián)合指南推薦的一線化療方案卡鉑+紫杉醇，但由于其有明顯的組織學(xué)和分子學(xué)異質(zhì)性，約50%患者復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)中位時間為16個月[20]，獲得性耐藥往往發(fā)生在疾病復(fù)發(fā)期，對于復(fù)發(fā)、鉑耐藥或鉑抵抗患者的治療較為復(fù)雜，整體預(yù)后較差。研究發(fā)現(xiàn)TP53突變、乳腺癌易感基因1/2（BRCA1/2）逆轉(zhuǎn)突變是卵巢癌產(chǎn)生鉑耐藥的主要分子變化[21]，但卵巢癌的耐藥基因及敏感基因檢測受限于術(shù)后組織活檢取樣困難，耐藥性監(jiān)測需要一種有效的非侵入性方法。利用ctDNA可及時、非侵入性檢測到耐藥突變的發(fā)生，及時調(diào)整治療方案，為尋找新的治療靶點提供依據(jù)，推動靶向治療進(jìn)程。

25%的卵巢癌患者攜帶致病性BRCA1/2突變，且對聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（PARP1）抑制劑有良好的治療反應(yīng)。有研究者在31%鉑耐藥和鉑抵抗的HGSC患者cfDNA中檢測到BRCA逆轉(zhuǎn)突變[22]。Christie等[23]對30例BRCA1/2種系突變的HGSC患者血漿標(biāo)本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)部分患者可檢出BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變，所有逆轉(zhuǎn)突變的患者在后續(xù)治療中都出現(xiàn)了鉑類和PARP抑制劑耐藥的情況，使用dPCR得到同樣的結(jié)果[24]?？梢夿RCA逆轉(zhuǎn)突變與卵巢癌耐藥性的發(fā)生具有相關(guān)性，ctDNA能無創(chuàng)地檢測出卵巢癌化療藥物耐藥的逆轉(zhuǎn)突變，及時了解機(jī)體的耐藥情況。表觀遺傳學(xué)方面，檢測卵巢癌患者ctDNA基因異常甲基化，可提前2年診斷卵巢癌，且能評估機(jī)體化療后對鉑類化療藥物的應(yīng)答情況[25]。最新靶向治療藥物貝伐單抗和PARP抑制劑奧拉帕尼[26]，在BRCA突變（體系和胚系）及部分同源重組缺陷（HDR）患者體內(nèi)可獲得最大藥物效用。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)奧拉帕尼用于BRCA胚系突變且既往至少經(jīng)過3線化療的復(fù)發(fā)性卵巢癌患者；盧卡帕利被批準(zhǔn)用于BRCA突變且至少經(jīng)過2線化療的鉑敏感或鉑耐藥性晚期卵巢癌患者。利用ctDNA檢測BRCA突變?yōu)槁殉舶┌邢蛩幬锏倪x擇提供依據(jù)。

在卵巢癌耐藥動物模型及細(xì)胞實驗中，上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）的相關(guān)基因與卵巢癌化療藥物順鉑的耐藥性有一定相關(guān)性，且逆轉(zhuǎn)EMT過程后，細(xì)胞的耐藥性有所降低[3，27]。通過ctDNA檢測患者血漿EMT相關(guān)基因突變，可以作為卵巢癌患者獲得性耐藥的監(jiān)測手段，并指導(dǎo)靶向治療。通過ctDNA動態(tài)監(jiān)測藥物靶向位點變化，實現(xiàn)靶向藥物的用藥指導(dǎo)，減少由于耐藥而發(fā)生的治療失敗或疾病復(fù)發(fā)的情況，對患者制定個性化治療方案，達(dá)到精準(zhǔn)施藥的效果，推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的前進(jìn)與發(fā)展。

3.3 療效預(yù)測與評估卵巢癌的治療在化療方案、敏感藥物個體化選擇方面仍有欠缺，治療后需長期密切的監(jiān)測與隨訪。卵巢癌殘留病灶的檢測是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的診斷難點和關(guān)鍵點，大多數(shù)患者即使行完全減瘤手術(shù)及規(guī)范性化療后仍有很大可能復(fù)發(fā)。所以盡早發(fā)現(xiàn)微小病灶，檢測殘留和轉(zhuǎn)移，既能提早干預(yù)臨床復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險，又能避免術(shù)后治愈的患者接受過度的輔助治療。

Balaji等[28]對包括卵巢癌在內(nèi)的180例腫瘤患者的血漿樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ctDNA能可靠監(jiān)測腫瘤的特異性突變，高水平ctDNA與不良生存結(jié)局相關(guān)，無法檢測的ctDNA與良好生存結(jié)局相關(guān)。1例術(shù)后診斷為ⅢC期漿液性乳頭狀卵巢癌的患者，基因檢測時發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子受體2（FGFR2）陽性表達(dá)，在術(shù)后的治療過程中，監(jiān)測ctDNA中FGFR2融合表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，ctDNA特異性融合與患者機(jī)體卵巢癌細(xì)胞的持續(xù)存在具有一致性[29]。在一項Meta分析中發(fā)現(xiàn)，cfDNA KRAS突變與卵巢癌總生存期（OS，P＜0.01）和無進(jìn)展生存期（PFS，P＜0.01）較低有關(guān)，是患者生存預(yù)后的重要生物標(biāo)記物[30]。Morikawa等[10]對29例卵巢透明細(xì)胞癌（OCCC）組織和cfDNA進(jìn)行突變基因分析，5例OCCC組織及其中2例cfDNA PIK3CA突變陽性，3例OCCC組織及其中1例cfDNA KRAS突變陽性。隨后監(jiān)測陽性患者cfDNA水平變化，cfDNA突變升高早于臨床發(fā)現(xiàn)疾病轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和死亡，而CA125升高不明顯且較慢。由此可見，根據(jù)患者ctDNA基線水平和卵巢癌的特異性突變基因檢測，能有效預(yù)測卵巢癌患者的預(yù)后，實現(xiàn)患者管理。

BRCA1/2突變和TP53突變是卵巢癌常見的基因突變類型。BRCA1/2突變不僅與卵巢癌的化療耐藥具有相關(guān)性，還可以監(jiān)測和評價患者預(yù)后。Ratajska等[31]檢測121例卵巢癌患者腫瘤組織和ctDNA的BRCA1/2體細(xì)胞突變，兩者具有一致性，ctDNA可以覆蓋腫瘤組織中所有的BRCA1/2種系突變，且與突變陽性者相比，BRCA逆轉(zhuǎn)突變陰性者PFS顯著延長（P＜0.000 1）[22]。

90%以上的HGSC患者存在TP53突變。Kim等[32]檢測HGSC組織和血漿TP53突變，符合率為100%。對突變基因進(jìn)行等位基因計數(shù)（TP53MAC）后發(fā)現(xiàn)，ctDNA TP53突變含量與卵巢癌的手術(shù)減瘤程度呈正相關(guān)；化療結(jié)束3個月后再次提取ctDNA，并根據(jù)ctDNA計數(shù)分為高TP53MAC組（≥0.2拷貝/L）和低TP53MAC組（＜0.2拷貝/L），高TP53MAC組患者的疾病進(jìn)展時間（TTP）較低TP53MAC組明顯縮短（P=0.038），TP53MAC與TTP具有相關(guān)性；治療結(jié)束后ctDNA TP53監(jiān)測比CA125更敏感地反應(yīng)病灶殘留與復(fù)發(fā)。Parkinson等[33]對318例卵巢癌患者治療前ctDNA進(jìn)行TP53MAC，發(fā)現(xiàn)TP53MAC與腫瘤大小呈正相關(guān)，引流癌性腹水后兩者的相關(guān)性增強(qiáng)?；熃Y(jié)束后再次檢測TP53MAC，發(fā)現(xiàn)TP53MAC下降大于60%的患者對化療較為敏感，TTP較長，具有較良好的預(yù)后。可見術(shù)后ctDNA檢測可以對卵巢癌進(jìn)行預(yù)后評價，并為術(shù)后殘余病灶提供證據(jù)，早期識別高復(fù)發(fā)風(fēng)險患者。

ctDNA作為表觀遺傳學(xué)變化的測量工具，卵巢癌異常甲基化特別是啟動子/增強(qiáng)子異常甲基化是抑癌基因失活的重要機(jī)制。Thomsen等[20]用貝伐珠單抗聯(lián)合生育三烯醇對23例晚期鉑耐藥卵巢癌患者進(jìn)行臨床試驗，根據(jù)血漿HOXA9腫瘤特異性甲基化DNA（HOXA9-meth-ctDNA）水平對1個化療周期后的患者進(jìn)行分組，水平穩(wěn)定或下降者中位PFS為7.8個月，中位OS為12個月；高HOXA9-methctDNA水平者中位PFS為1.4個月，中位OS為4.3個月，PFS及OS明顯縮短（P＜0.05），而腫瘤組織中的突變未發(fā)現(xiàn)這一關(guān)聯(lián)，提示ctDNA突變水平在治療反應(yīng)和預(yù)后評估中是極為敏感的。

BRCA1/2致病性突變與卵巢癌、輸卵管癌和腹膜癌的發(fā)生顯著相關(guān)[34]，有20%的卵巢癌存在BRCA1/2致病性突變。對于有卵巢癌家族史等高危人群，可以將ctDNA作為定期體檢篩查手段，對于ctDNA陽性人群予以密切追蹤，爭取早期診斷與疾病干預(yù)，可適度降低卵巢癌高風(fēng)險者預(yù)防性手術(shù)的實施，提高治愈率，改善患者預(yù)后。這些充分體現(xiàn)了ctDNA作為一種腫瘤特異性生物標(biāo)記物在監(jiān)測病情和療效評價上具有明顯優(yōu)勢。

4 結(jié)語與展望

目前ctDNA檢測方法多樣，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、樣本收集不統(tǒng)一等問題很容易造成卵巢癌檢測的假陽性結(jié)果，是目前面臨的主要挑戰(zhàn)。Merker等[35]和Diamandis等[36]認(rèn)為，ctDNA在早期癌癥診斷篩查、治療監(jiān)測和殘留病灶檢測中存在局限，不僅因為深度全基因組測序揭示突變能力有限，而且血液中提取ctDNA數(shù)量非常少，不太可能有效診斷癌癥。Cohen等[13]在1 005例非轉(zhuǎn)移性癌癥患者中檢測ctDNA，結(jié)合腫瘤標(biāo)志物開發(fā)一項名為“CancerSEEK”的LB技術(shù)，卵巢癌的中位敏感度為70%，特異度為99%，但Ⅰ期卵巢癌的敏感度僅為43%，早期卵巢癌敏感度低限制了其在診斷中的應(yīng)用價值。相對于其他實體腫瘤來說，卵巢癌的隱匿性使ctDNA比其他現(xiàn)有檢測手段更有價值，所以ctDNA在卵巢癌中的應(yīng)用值得推廣。很多學(xué)者提出通過聯(lián)合檢測來提高敏感度，在CA125、HE4和超聲成像基礎(chǔ)上或陰道細(xì)胞涂片、子宮內(nèi)膜細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)上聯(lián)合ctDNA，卵巢癌檢測的敏感度從43%提高到63%[37]。

ctDNA作為LB技術(shù)，在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌的研究較為廣泛，而在卵巢癌的研究較少，目前全球已有的141項ctDNA臨床試驗中婦科腫瘤僅20項[38]。ctDNA在卵巢癌應(yīng)用中的無創(chuàng)性、可重復(fù)性和特異性受到了廣泛認(rèn)同，在卵巢癌的疾病診斷、預(yù)后評價和耐藥性監(jiān)測中具有重要的臨床意義。未來，我們還需要通過大量研究尋找并篩選敏感度和特異度更高的分子指標(biāo)，結(jié)合現(xiàn)有的分子指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合檢測，實現(xiàn)卵巢癌早期診斷，提供良好的治療靶點，實現(xiàn)個體化治療。